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CD44v3在肺腺癌细胞A549侵袭中的作用

马丹  
【摘要】: 第一部分干扰CD44v3的表达对肺腺癌A549细胞侵袭行为的影响 目的研究肺腺癌细胞A549的侵袭能力和粘附分子CD44v3表达的关系。 方法用pRNAT-H1.1/Neo(6.1kb)质粒构建一个能够稳定转录短发卡RNA(shRNA)并干扰CD44v3分子表达的表达载体,将其转染A549细胞。实验分为野生型A549细胞组、空载质粒转染组和干扰质粒转染组3组。用荧光免疫组织细胞化学法和免疫印渍(Western Blot)检测、比较3组A549细胞CD44v3表达的差异。用Boyden室和人工基底膜构建癌细胞的离体侵袭模型,实验分组中增加CD44v3单克隆抗体组,计数并比较4组穿过人工基底膜的A549细胞的细胞数。 结果实验中发现肺腺癌细胞A549表达CD44v3分子,分子量为130kd。质粒表达载体能够有效的干扰A549细胞表达CD44v3,在转染率为48.1%时,空载对照组的蛋白表达量较野生型组下降22%,而CD44v3蛋白表达空载质粒组下降46%。细胞荧光免疫组织化学染色发现野生型A549细胞细胞膜上红色荧光呈环状包绕细胞,空载质粒组细胞既可看到细胞膜上红色荧光,也可看到胞浆的绿色荧光,而干扰组只能看到胞浆的绿色荧光。A549细胞离体侵袭模型发现野生型组、空载质粒组、干扰组和CD44v3单克隆抗体阳性对照组中穿过基底膜的A549细胞数分别是20.40±2.51、13.20±4.92、4.0±1.22和4.6±1.82;单变量方差分析各处理组间差异显著,F=31.3,P<0.01。各批次处理组间差异不明显,F=0.636,P>0.05。验后多重比较检验发现只有干扰组和单克隆抗体组之间差异不明显,P>0.05,其余各组间两两比较均为P<0.01。其中干扰组较空载质粒组下降70%。 结论肺腺癌细胞A549表达CD44v3分子,用RNAi技术,构建并转染RNA干扰质粒表达载体后可降低CD44v3的表达。降低A549细胞CD44v3的表达可抑制该细胞的的离体侵袭能力。 第二部分A549细胞的CD44v3表达和其在体侵袭行为的关系 目的研究肺腺癌细胞系A549细胞CD44v3的表达和癌细胞经异体皮下移植后的在体侵袭行为的关系。 方法构建CD44v3的RNA干扰质粒表达载体,将其转染到肺腺癌细胞A549中。实验根据所用A549细胞的不同分为3组,未作处理的A549细胞野生型组、转染空载载体的A549细胞空载组和转染干扰载体的A549细胞干扰组。分离制作3组细胞的混悬液,分别将其接到BALB/c裸鼠皮下,观察记录移植瘤的生长,第7周处死裸鼠留取移植瘤及其周边组织,常规HE染色和SP免疫组织化学二氨基联苯胺(DAB)染色后镜下病理检测。比较3组不同处理的癌细胞移植成功率、生长潜伏期、移植瘤体积大小及对周边组织的侵袭程度,并用图象分析系统比较3种癌细胞和胃癌阳性对照、PBS阴性对照的灰度值。 结果3组移植瘤的成功率比较虽然有所不同,但统计学结果显示无明显差异。3组移植瘤的生长潜伏期比较发现干扰组的潜伏期明显长于野生型组和空载组,而野生型组和空载组之间无明显差异。3组移植瘤肿块体积大小比较发现干扰组的体积明显小于野生型组和空载组,而野生型组和空载组之间无明显差异。HE染色镜下野生型组和空载组可见Ⅰ—Ⅱ癌组织向周边组织侵袭,干扰组未见癌组织的侵袭。免疫组化染色发现野生型组和空载质粒组的染色结果和胃癌阳性对照片一致,干扰组免疫组化染色和前三者比较明显不同,和阴性对照片一致;图象分析灰度比较3组移植瘤和胃癌阳性对照、PBS阴性对照发现胃癌阳性对照组、野生型组、和空载质粒组3组之间两两比较无明显差异(P>0.05),干扰组和PBS阴性对照组之间无明显差异(P>0.05),干扰组、PBS阴性对照组分别和胃癌阳性对照组、野生型组、和空载质粒组之间两两比较有显著差异(P<0.01)。 结论肺腺癌细胞系A549细胞的在体侵袭行为和其CD44v3的表达有关,干扰降低(knock down)CD44v3的表达可抑制A549细胞的侵袭行为。


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