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生物标志物的检测方法研究

张迟  
【摘要】: 生物标志物是包括反映生物系统与环境中化学、物理或生物因素之间相互作用的任何测定指标,可将其分为三类:(1)接触的生物标志物(biomarker ofexposure),即反映机体生物材料中外源性物质或其代谢物或外源性物质与某些靶细胞或靶分子相互作用产物的含量,包括反映内剂量和生物效应剂量两类标志物;(2)效应的生物标志物(biomarker ofeffect),指机体中可测出的生化、生理、行为或其他改变的指标,包括反映早期生物效应(early biological effect)、结构和(或)功能改变(altered structure/functon)及疾病(disease)3类标志物;(3)易感性的生物标志物(biomarker of susceptibility),即反映机体先天具有或后天获得的对接触外源性物质产生反应能力的指标。 在现有的生物标志物中,单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms,SNPs)及蛋白质是两类最主要的基于人类基因组研究成果的标志物。本研究旨在建立这两种生物标志物的新的检测方法。 SNPs是人类基因组中最常见的突变。它是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A,T,C,G)的替换而引起的多态性。它对“个性”起着决定的作用,导致了人类群体的遗传多样性,形成不同个体或群体对疾病的易感性不同,对药物和环境攻击(如细菌、病毒、毒物、化学品)的反应也不同。这使SNPs在生物医学研究、药物研究以及临床治疗上有着极大的价值。因此如何采用大规模和高通量的方法来发现、检测、研究与利用SNPs,已引起了科学家和商业公司的极大兴趣和激烈角逐。 蛋白质标志物的不断发现,是蛋白质组学的重要研究成果。在人类基因组计划完成后,生命科学面临的最重要任务之一就是对人类基因调节与功能的注释与确认,即进入所谓的“后基因组时代(Human Genome Project,HGP)”。由于基因的功能主要通过其编码的蛋白质来实现,蛋白质是生命活动真正的执行者,蛋白质组学被认为是后基因组研究中的最主要部分。研究疾病有关的蛋白质是蛋白质组学的重要范畴之一。通过蛋白质组研究,大量与疾病有关的蛋白质标志物被发现并用于医疗实践。随着蛋白质组学研究的深入,成千上万存在于不同组织或细胞,对内源或外源刺激、信号传导、转录控制、药物治疗、疾病或病原体产生上调或下调应答反应,并作为与疾病的发生、发展及预后有关的标志物,以及新分子药靶的蛋白质,有望被开发出来。由于与疾病早期发病有关的蛋白质标志物往往浓度非常低,因此对于与疾病有关蛋白质的发现以及将其用于疾病的诊断与治疗,都急需超灵敏检测与定量蛋白质的方法。 第一部分利用连接介导的SAGE技术检测单核苷酸多态性 检测SNP的方法目前有很多,但对于SNP的检测方法学研究主要集中在开发大规模和高通量的方法来发现、检测、研究与利用SNPs。当前高通量的SNP分析技术主要有基因芯片技术(gene chip)、荧光共振法与荧光偏振法、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、变性高效液相色谱技术(DHPLC)、微球阵列技术(Bead array)及质谱基因分型方法等,其中大规模高通量的基因分型方法以基因芯片(GeneChip)技术和微球阵列(Bead Array)技术为代表,中等通量SNP分型的代表技术是基于“引物延伸法”的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-—TOF)基因分型技术和荧光偏振光基因分型技术。这几种方法都有其缺点,如,GeneChip与BeadArray需要合成、设计大量的寡核苷酸探针,质谱法需昂贵的仪器设备对技术人员的技术要求较高,荧光偏振光技术的分析结果容易受到非特异性产物的影响。因此建立一种高通量检测SNPs的新平台,是我们的研究出发点。 本研究利用基因表达连续分析研究方法(serial analysis of gene expression,SAGE),建立了一种高通量检测单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms,SNPs)新方法,简称该方法为LM-SAGE。 具体的方法是,首先利用CEL I核酸内切酶将由野生型与突变型DNA形成的杂交双链酶切为带粘端的双链,然后连接到连接子,通过Mme I内切酶酶切得到含错配位点的17个碱基对的标签序列,接着将标签序列连接形成标签串并进行克隆测序。根据所测得的标签序列可以定位SNPs的位置。 实验结果如下:(1)该方法能同时检测出8种错配(A/G,G/T,C/TA/C,A/A,C/C,G/G,T/T);在检测时不需要要SNPs的序列信息;(2)LM-SAGE需要初始样本量很小,能正确定位8种错配的最小初始样本量为2.4×106个分子;(3)对不同突变比例的样本进行检测,在野生型DNA样本高出突变型10倍时均被检出,8种错配均能被检出并定位。 结果表明,LM-SAGE方法易于操作,如果结合利用商业测序服务时,不需要特别的仪器设备;不但能用于检测已知SNPs,也能在没有DNA序列信息的情况下,发现未知SNPs,并能对SNPs进行定位;LM-SAGE是一高通量检测SNPs的有效方法。 本研究的创新之处在于,第一次将基因SAGE(serial analysis ofgene expression,表达连续分析研究方法)技术思路用于SNPs的检测,与其他方法相比较,本研究方法简单,易于掌握,如果利用商业测序服务,不需要配备任何昂贵的仪器,不需要待测样本的序列信息,就可以开展SNPs的检测,并进行定位。如果对本方法进行进一步的研究与推广,一定会对SNPs的研究、开发与利用起到推动作用。 第二部分纳米颗粒修饰寡核苷酸适配子检测蛋白质的方法研究 目前传统的检测蛋白质的方法如ELISA或免疫印迹方法已不能满足蛋白质标志物研究与应用的需要,超灵敏的检测方法主要是采用抗体来进行,采用寡核苷酸适配子(Aptamer)来进行蛋白质的检测方法研究还处在初级阶段。Aptamer是一类与抗体一样,与靶蛋白质高亲和力的寡核苷酸,它与蛋白质之间的亲和力有时比抗体的亲和力还强,并具有特异性,因此可以成为蛋白质分析的有力工具。当前利用Aptamer的蛋白质检测方法,有的灵敏度不是很高,有的虽有较高灵敏度,但需要昂贵的仪器,本研究利用金纳米颗粒(Au nanoparticle,Au NP)修饰的Aptamer来建立一个蛋白质检测的新方法,与其他方法相比,本方法有较高灵敏度、不需昂贵仪器,简单快捷,具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。 本研究旨在建立一种检测蛋白质标志物的新方法。具体方法是,以AuNP修饰的Aptamer与蛋白质结合,同时另一个生物素化的寡核苷酸适配子也结合于蛋白质,构成一个三明治形式的复合物,接着三明治复合物被卵白素结合于酶标板上,然后以银离子强化法来放大三明治复合物上的蛋白质浓度信息,最后用比色法对蛋白质浓度信息进行检测。在本文中我们以血小板源生长因子(platelet-derivedgrowth factor B-chain,PDGF-BB)作为检测样本来检验本方法的灵敏度与检出限。 结果如下:(1)本研究可以得到吸光度与PDGF-BB浓度的剂量-效应关系曲线,在一定的浓度范围内(1fM~1μM),吸光度与PDGF-BB浓度的对数值呈线形相关,决定系数R2=0.9801;(2)本方法可以检测出1 fmol/L的靶蛋白质;(3)方法可以用于检测生物样品中的PDGF-BB。 结果表明,本方法具有灵敏度高,操作简单快速的特点,是一种新颖而应用前景的蛋白质标志物分析方法。


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