p16-Rb-HDAC1-E2F1对胆道癌的生长作用及其蛋白信号传导通路研究

【摘要】： 肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的过程，涉及染色体畸变、抑癌基因的失活、癌基因的活化、细胞周期的调控、基因启动子的转录活化和表遗传学等诸多方面。而对肿瘤的研究也广泛开展在这些纷繁芜杂的方面中。随着人类基因组测序工作完成，人类已进入后基因组时代，基因调控即遗传信息是如何精确调控和准确表达的成为当今的重点研究方向。而遗传信息的调控和表达是在蛋白信号的传导和作用下完成的，所以对蛋白质的研究成为新的研究热点。 在邹声泉教授的领导下，我们的课题组在前期的研究中发现抑癌基因p16和组蛋白乙酰化酶HDAC1与肝外胆管癌的细胞分子遗传学和表遗传学有关联，提示其在肝外胆管癌的发生和发展中扮演着重要角色。另有研究认为，Rb／E2F1途径是细胞周期调控的中心环节并可以调节HDAC1的活性进而影响DNA乙酰化，Rh／p16途径在肿瘤中的作用也逐渐得到公认。这些研究结果提示，p16、Rb、HDAC1和E2F1之间可能在胆道肿瘤中存在一个具有相互反馈调节功能的蛋白信号传导通路。这些蛋白信号涉及抑癌基因的失活、组蛋白乙酰化、基因启动子转录活化和肿瘤表遗传学等诸多方面，所以其在肿瘤演变过程中极具有代表性。 为此本课题从研究肝外胆管癌和胆囊癌p16、Rh、HDAC1和E2F1之间的蛋白信号传导着手，应用质粒转染、免疫沉淀、Western blot、RT-PCR、MTT和免疫组化等实验方法，从细胞水平到组织水平，从体外作用到体内作用，多角度、多层面的研究这些蛋白信号的传导途径及其蛋白质之间的相互作用，探讨这些蛋白的功能及其与肿瘤的基因调控和表遗传学等方面的关系，期望能够为阐明其在胆道癌中的作用机制提供新的理论基础和实验依据。同时将这些蛋白质的表达特征与胆道癌的临床流行病学相联系，期望能从众多纷繁的临床特征中找到与这些蛋白质相关联的因素，从而为寻找胆道癌的病因提供新的证据。但由于时间的关系，本课题尚局限于较浅的层面，在今后的工作中我们将进一步深入研究。 第一部分胆道癌p16-Rb-HDAC1-E2F1中各种蛋白质之间的相互作用及其信号传导途径的研究 论文1 p16-Rb-HDAC1-E2F1在胆道癌细胞系中的表达 目的研究p16-Rb-HDAC1-E2F1中各种蛋白及其mRNA在肝外胆管癌和胆囊癌细胞系中的表达情况。 方法用免疫组织化学和RT-PCR方法检测肝外胆管癌细胞系(QBC_(939)、KMBC、OZ cell lines)和胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1 cell line)中p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白及其mRNA的表达。 结果 1．P16 mRNA在QBC_(939)细胞有弱表达，在KMBC细胞、Mz-ChA-1细胞和OZ细胞无表达；Rb mRNA在KMBC细胞有弱表达，在QBC_(939)细胞、Mz-ChA-1细胞和OZ细胞无表达；HDAC1 mRNA在QBC_(939)细胞、KMBC细胞、OZ细胞和Mz-ChA-1细胞均有弱表达；E2F1 mRNA在QBC_(939)细胞、KMBC细胞和Mz-ChA-1细胞有弱表达，在OZ细胞无表达。p16蛋白在QBC_(939)细胞有表达；Rb蛋白在KMBC细胞有表达；HDAC1蛋白在QBC_(939)细胞、KMBC细胞、OZ细胞和Mz-ChA-1细胞均有表达；E2F1蛋白在QBC_(939)细胞、KMBC细胞和Mz-ChA-1细胞有表达。 2．P16蛋白在QBC_(939)细胞种植瘤中有弱表达；Rb蛋白在KMBC细胞种植瘤中有弱表达；HDAC1蛋白在QBC_(939)、KMBC、OZ和Mz-ChA-1细胞种植瘤中有表达，但表达丰度在同种细胞种植瘤中不同；E2F1蛋白在QBC_(939)、KMBC和Mz-ChA-1细胞种植瘤中有弱表达。 结论P16、Rb、HDAC1、E2F1参与了胆道癌的进程；体内环境可对胆道癌细胞系的生物学特性产生影响。 论文2胆道癌p16-Rb-HDAC1-E2F1中各种蛋白质之间的相互作用研究 目的研究胆道癌p16-Rb-HDAC1-E2F1中各种蛋白质之间的相互作用及其机理。 方法用免疫沉淀法检测分别转染p16质粒和pRb质粒的肝外胆管癌细胞系(QBC_(939)、KMBC、OZ cell lines)和胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1 cell line)的p16-Rb-HDAC1-E2F1中各种蛋白质之间的相互作用。 结果 1．用HDAC1抗体免疫沉淀下来的蛋白中有Rb蛋白(在QBC_(939)、KMBC、OZ和Mz-ChA-1细胞系)和E2F1蛋白(在QBC_(939)、KMBC和Mz-ChA-1细胞系)的存在，无p16蛋白存在。 2．用Rh抗体免疫沉淀下来的蛋白中有HDAC1蛋白(在QBC_(939)、KMBC、OZ和Mz-ChA-1细胞系)和E2F1蛋白(在QBC_(939)、KMBC和Mz-ChA-1细胞系)的存在，无p16蛋白存在。 结论 1．胆道癌Rb蛋白、HDAC1蛋白和E2F1蛋白之间在细胞水平存在特异的相互作用，表明其蛋白信号之间存在直接的传导途径。 2．P16蛋白在胆道癌中与Rb蛋白、HDAC1蛋白和E2F1蛋白之间并不存在直接的相互作用。 第二部分p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白与胆道癌生物学特性的关系 论文3 p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白在胆道癌细胞中的作用及其相互影响 目的研究p16-Rb-HDAC1-E2F1在体内、体外对肝外胆管癌细胞系(QBC_(939)、KMBC、OZ cell lines)和胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1 cell line)生长的作用及其各蛋白之间的相互影响。 方法 1．转染p16质粒和pRh质粒进入肝外胆管癌细胞系(QBC_(939)、KMBC、OZ celllines)和胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1 cell line)，用MTT法检测转染前后各胆道癌细胞系生长的变化，用RT-PCR法检测转染p16质粒前后各胆道癌细胞系Rb mRNA的表达变化和转染pRb质粒前后各胆道癌细胞系p16 mRNA的表达变化。 2．用与HDAC1功能相反的去乙酰化酶抑制剂-曲古抑菌素(trichostatinA，TSA)作用于肝外胆管癌细胞系(QBC_(939)、KMBC、OZ cell lines)和胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1 cell line)，用MTT法检测TSA对这些胆道癌细胞系生长的影响。 3．分别将转染p16质粒、pRb质粒和经TSA处理的胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1cell line)接种裸鼠皮下建立胆囊癌裸鼠种植模型，观察其转染p16质粒和pRb质粒前后和TSA处理前后裸鼠体内种植瘤生长的变化。 结果 1．转染p16质粒的KMBC细胞的Rb mRNA的表达受到抑制。转染pRb质粒的OZ和Mz-ChA-1细胞的p16 mRNA出现弱表达，QBC_(939)细胞和KMBC细胞的p16mRNA的表达无变化。 论文4 HDAC1与凋亡在胆囊癌中的相关性及其在免疫逃逸机制中的作用研究 目的 1．研究凋亡的死亡信号受体途径(Fas／FasL途径)和组蛋白去乙酰化酶HDAC1在胆囊癌生物学行为中的作用。 2．探讨HDAC1在胆囊癌免疫逃逸机制中的相关作用和机制。 方法 1．应用免疫组织化学方法研究胆囊癌组织、胆囊腺瘤组织、胆囊上皮不典型增生组织和慢性胆囊炎组织中Fas／FasL蛋白的表达和HDAC1蛋白的表达情况。 2．运用TUNEL法检测在胆囊癌组织、胆囊腺瘤组织、胆囊上皮不典型增生组织和慢性胆囊炎组织中的原位组织细胞的凋亡情况及其浸润的淋巴细胞的凋亡情况。 3．比较在不同的胆囊癌临床病理类型中Fas蛋白和FasL蛋白的表达情况的差异和在原位胆囊癌组织浸润的淋巴细胞的凋亡情况的差异。 4．探讨胆囊癌Fas／FasL蛋白的表达与组蛋白去乙酰化酶HDAC1蛋白的表达的相关性。 结果 1．Fas蛋白表达的阳性率在胆囊癌组织、胆囊腺瘤组织、胆囊上皮不典型增生组织和慢性胆囊炎组织之间的差异无显著意义。FasL蛋白表达的阳性率在胆囊癌组织显著高于慢性胆囊炎组织(X~2=4.89，P＜0.05)。 2．胆囊癌的组织细胞的凋亡指数显著高于胆囊腺瘤的组织细胞(t′=4.19，P＜0.01)和慢性胆囊炎的组织细胞(t′=8.06，P＜0.01)的凋亡指数；高分化的胆囊癌的组织细胞的凋亡指数显著低于低分化的胆囊癌的组织细胞的凋亡指数(t′=2.63，P＜0.05)，NevinⅠ、Ⅱ、Ⅲ期的胆囊癌的组织细胞的凋亡指数显著低于NevinⅣ、Ⅴ期的胆囊癌的组织细胞的凋亡指数(t′=3.33，P＜0.01)。 3．浸润的淋巴细胞的数量在胆囊腺瘤组织显著低于在胆囊癌组织(t′=6.99，P＜0.01)，在慢性胆囊炎组织显著低于在胆囊腺瘤组织(t′=3.66，P＜0.01)；在高分化胆囊癌组织显著低于在低分化胆囊癌组织(t′=5.31，P＜0.01)，在胆囊癌NevinⅠ、Ⅱ、Ⅲ期组织显著低于在胆囊癌NevinⅣ、Ⅴ期组织(t=-3.76，P＜0.01)。 4．浸润的淋巴细胞的凋亡数量在高分化的胆囊癌组织显著低于在低分化的胆囊癌组织(t=-2.52，P＜0.05)；在NevinⅠ、Ⅱ、Ⅲ期的胆囊癌组织中浸润的淋巴细胞的凋亡数量与在NevinⅣ、Ⅴ期的胆囊癌组织浸润的淋巴细胞的凋亡数量之间的差异无显著意义(t=-1.42，P＞0.05)；在胆囊腺瘤组织中和慢性胆囊炎组织中未见到浸润的淋巴细胞的凋亡。 5．HDAC1蛋白和FasL蛋白在胆囊癌组织的表达呈显著正相关(P＜0.05)，HDAC1蛋白和Fas蛋白在胆囊癌组织的表达无显著相关性。 结论 1．胆囊癌组织细胞表达的FasL通过诱导在癌组织浸润的淋巴细胞的凋亡从而使癌细胞逃避机体的免疫监视，它的上调表达在胆囊癌的分化、浸润和转移过程中扮演着重要角色。 2．未证实胆囊癌组织细胞表达的Fas蛋白在胆囊癌的免疫逃逸中具有作用。 3．组蛋白去乙酰化酶HDAC1蛋白和参与胆囊癌免疫逃逸的FasL蛋白在胆囊癌组织的表达呈显著正相关，提示我们HDAC1与胆囊癌的免疫逃逸具有一定的相关性。 第三部分组蛋白去乙酰化酶抑制剂对胆道癌p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白信号传导的影响 论文5组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肝外胆管癌细胞和胆囊癌细胞p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白信号传导的影响 目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂-曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)对肝外胆管癌和胆囊癌p16-Rh-HDAC1-E2F1蛋白信号传导的影响。 方法用TSA作用于肝外胆管癌细胞系(QBC_(939)、KMBC、OZ cell lines)和胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1 cell line)，然后用RT-PCR检测p16、Rb、HDAC1、E2F1之mRNA的表达变化，用Western blot检测其蛋白的表达变化。将这些细胞接种在裸鼠皮下建立肝外胆管癌和胆囊癌裸鼠种植瘤模型，用免疫组织化学方法观察TSA在体内对裸鼠种植瘤组织中Rb、HDAC1、DNMT1、E2F1蛋白表达的影响。 结果 1．TSA可以减弱肝外胆管癌细胞系(QBC_(939)、KMBC、OZ cell lities)和胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1 cell line)HDAC1 mRNA和蛋白的表达；增强KMBC细胞系p16 mRNA和蛋白的表达；对各细胞系Rh和E2F1 mRNA和蛋白的表达无影响。 2．TSA作用前后的肝外胆管癌细胞系和胆囊癌细胞系裸鼠成瘤组织中的各种蛋白的表达均无变化。 结论TSA可以抑制肝外胆管癌和胆囊癌HDAC1的表达，并在Rb阳性的细胞中促进p16的表达，从而进一步影响遗传信息的转录。TSA的作用存在时效性。 第四部分p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白与胆囊癌临床病理学的关系 论文6 p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白与胆囊癌临床病理学因素的关系分析 目的探讨胆囊癌的临床病理学特征并研究p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白与胆囊癌临床病理学因素的关系及其意义。 方法 1．回顾性分析华中科技大学附属同济医院1991-2005年收治的65例胆囊癌病例。 2．应用免疫组化法研究胆囊痛组织中p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白的表达水平及特征。 结果 1．本组胆囊癌合并胆囊结石的比例为44.64％(25／56)。胆囊癌患者有乙肝病史的比例为26.79％(15／56)，有血吸虫疫水接触史的比例为30.36％(17／56)。多产者比例为72.98％(27／37)。本组胆囊癌病例占同期胆囊切除术总数的0.64％(56／8807)。术前误诊疾病依次为结石、腺瘤和肝癌。影像学检查中，B超的正确率为42.3％(22／52)，CT的正确率为57.1％[(14-6)／(20-6)]，MRI的正确率为50％[(5-2)／(8-2)]。有4例胆囊癌患者检查了血γ-GT，其结果均高于正常值。 2．本组胆囊癌原发部位多位于胆囊颈部(29.73％，11／37)和体部(29.73％，11／37)，其次为胆囊底部(16.22％，6／37)，位于胆囊管部占5.41％(2／37)，位于胆囊体部和底部占13.51％(5／37)，另有5.41％(2／37)位于胆囊颈体交界部。胆囊癌组织学分型依次为腺瘤(83.93％，47／56)、腺瘤恶变(7.14％，4／56)、鳞癌(5.36％，3／56)和未分化癌(3.57％，2／56)。本组胆囊癌Nevin分期，Ⅰ期占14.29％(8／56)，Ⅱ期占10.71％(6／56)，Ⅲ期占26.79％(15／56)，Ⅳ期占14.29％(8／56)。胆囊癌分级，高分化占44.64％(25／56)，中分化占12.5％(7／56)，低分化占42.86％(24／56)。本组病例的胆囊癌的原发部位与肿瘤的分级、分期和患者性别均无显著相关性。胆囊癌转移部位多为肝脏(14／56)。有2例肿瘤组织浸润胆囊壁内神经束衣。 3．P16蛋白和Rb蛋白在胆囊癌组织中低表达，HDAC1蛋白和E2F1蛋白在胆囊癌组织中高表达，其表达均与胆囊癌的分化程度、Nevin分期、患者的年龄、性别和是否合并结石无显著相关性。P16蛋白在胆囊癌的表达率在合并乙肝者为27.7％，在没有合并乙肝者为55.6％，二者之间的差异具有显著性意义(P＜0.05)；Rb蛋白、HDAC1蛋白和E2F1蛋白在胆囊癌的表达均与患者是否合并乙肝无显著相关性。P16蛋白和Rb蛋白在胆囊癌的表达呈显著正相关(γ=0.6091，t=4.48，P＜0.001)，p16蛋白和HDAC1蛋白在胆囊癌的表达呈显著负相关(γ=-0.5215，t=3.56，P＜0.005)，Rb蛋白和HDAC1蛋白在胆囊癌的表达呈显著负相关(γ=-0.3953，t=2.51，P＜0.05)，E2F1蛋白和其它蛋白在胆囊癌的表达无显著相关性。 结论 1．胆囊结石、乙肝病毒感染、血吸虫感染和多产妇是胆囊癌的高危因素；γ-GT可能是胆囊癌有潜力的肿瘤标志物。 2．胆囊癌多位于胆囊颈部和体部，组织分型以腺癌居多，并具有沿神经浸润的特性；胆囊癌的恶性程度与其原发部位和患者性别无关。 3．P16蛋白、Rb蛋白、HDAC1蛋白和E2F1蛋白在胆囊癌的表达均与肿瘤的恶性程度、患者的年龄和性别无显著相关性。 4．P16蛋白在胆囊癌的表达与患者是否合并乙肝具有显著相关性。 5．P16蛋白、Rb蛋白的低表达和HDAC1蛋白、E2F1蛋白的高表达参与了胆囊癌的进程，并且p16蛋白、Rb蛋白和HDAC1蛋白在胆囊癌中具有相互协同作用。 目的探讨意外胆囊癌的临床病理学特征并研究p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白与意外胆囊癌临床病理学因素的关系及其意义。 方法回顾性研究同济医院23例意外胆囊癌病例，并和同期收治的33例术前确诊的胆囊癌病例进行比较分析，并应用免疫组化法研究意外胆囊癌组织中p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白的表达水平及特征。 结果意外胆囊癌合并胆囊结石的比例高于术前确诊的胆囊癌，差异有非常显著意义(P＜0.01)。患者有乙肝病史的比例在意外胆囊癌为21.74％(5／23)，在术前确诊的胆囊癌为30.30％(10／33)。患者有血吸虫疫水接触史的比例在意外胆囊癌为39.13％(9／23)，在术前确诊的胆囊癌为24.24％(8／33)。多产(大于三胎)的比例在意外胆囊癌为56.52％(13／23)，在术前确诊的胆囊癌为42.42％(14／33)。分别有2例意外胆囊癌和2例术前确诊的胆囊癌检查了血．γ-GT，其结果均高于正常值。意外胆囊癌的原发部位多位于胆囊颈部和体部，术前确诊的胆囊癌原发部位多位于胆囊体部和底部。意外胆囊癌的Nevin分期，在Ⅰ期和Ⅱ期的比例均高于术前确诊的胆囊癌，差异有显著意义(P＜0.05)；在Ⅳ期的比例低于术前确诊的胆囊癌，差异有显著意义(P＜0.05)；在Ⅴ期的比例低于术前确诊的胆囊癌，差异有非常显著意义(P＜0.01)。意外胆囊癌的分级，高分化者高于术前确诊的胆囊癌，差异有显著意义(P＜0.05)；低分化者低于术前确诊的胆囊癌，差异有显著意义(P＜0.05)。p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白的表达在意外胆囊癌和非意外胆囊癌的差异无显著性意义。 结论意外胆囊癌具有肿瘤原发部位以胆囊颈、体部居多、恶性程度较术前确诊的胆囊癌低和结石的并存率较术前确诊的胆囊癌高的特征；结石、乙肝、血吸虫和多产是意外胆囊癌的高危因素。意外胆囊癌和非意外胆囊癌具有相似的分子生物学特征。 本课题从研究蛋白质的功能着手，探讨了肝外胆管癌和胆囊癌p16-Rb-HDAC1-E2F1之间的蛋白信号传导途径及其蛋白质之间的相互作用，得出以下结论和创新点： 1．胆道癌p16-Rb-HDAC1-E2F1之间的蛋白信号传导涉及抑癌基因的失活、细胞周期的调控、组蛋白乙酰化、基因启动子的转录活化和肿瘤表遗传学等几个方面，本课题将它们结合起来进行研究，更有代表性的说明胆道癌演变过程的复杂性。 2．胆道癌Rb蛋白、HDAC1蛋白和E2F1蛋白之间在细胞水平存在特异的相互作用，表明其蛋白信号之间存在直接的传导途径。p16蛋白在胆道癌中与Rb蛋白、HDAC1蛋白和E2F1蛋白之间存在间接的相互作用，并且证实p16对胆道癌的抑制作用依赖于Rb的功能。提示在胆道癌中存在一个具有相互反馈调节功能的p16-Rb-HDAC1-E2F1蛋白信号传导通路。 3．本课题将蛋白质的信号传导与表遗传学结合起来进行研究，可以更全面的阐明遗传信息的精确调控和准确表达方式。我们的研究表明，胆道癌表遗传的改变能够通过对染色质基因转录的调节来影响癌细胞的增殖进程，而表遗传的改变与蛋白信号的传导密切相关。 4．肝外胆管癌和胆囊癌的手术切除率和对放疗、化疗的敏感性均差，本课题以邹声泉教授领导的研究团队的基础研究结果作为理论指导，观察了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在体内、体外对胆道癌细胞的抑制作用，为探索新的胆道癌的生物治疗手段进行了有益的尝试。 5．本课题组在邹声泉教授领导下的前期研究表明肝炎病毒感染与肝门胆管癌显著相关并可以引起相应基因的改变。本组资料研究结果表明，p16蛋白在胆囊癌的表达与患者是否合并乙肝具有显著相关性，提示乙型肝炎病毒感染可能参与了胆囊癌变过程中p16基因的缺失或者失活，从而为进一步揭示肝炎病毒在肿瘤癌变中的作用机制提供了新的证据。