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细胞移植及药物治疗血管性痴呆的实验研究

黄敬  
【摘要】: 第一部分:胆碱酯酶抑制剂治疗血管性痴呆的实验研究 目的观察胆碱酯酶抑制剂对慢性脑低灌注大鼠认知功能障碍的治疗作用并探讨其胆碱能机制。 方法双侧颈总动脉同时结扎后的大鼠采用盐酸多奈哌齐连续治疗6周,再将其水迷宫试验、事件相关诱发电位(ERP)、胆碱酯酶及胆碱酯酶阳性神经纤维的测定结果与正常组、低灌注组(双侧颈总动脉同时结扎六周)及盐水治疗组相比较。 结果低灌注组与正常组相比,水迷宫完成时间显著延长,错误次数显著增多(P<0.05),P300潜伏期显著延长(P<0.05),胆碱酯酶浓度及胆碱纤维密度也显著下降(P<0.05)。盐酸多奈哌齐治疗组其胆碱酯酶浓度及胆碱纤维密度较低灌注组及盐水治疗组进一步下降(P<0.05),但水迷宫试验结果却较低灌注组及盐水治疗组显著好转(P<0.05),P300潜伏期的测定值也均显著优于低灌注组及盐水治疗组(P<0.05)。 结论:慢性低灌注能显著影响大鼠的认知功能,认知功能下降与胆碱酯酶浓度及胆碱纤维密度显著下降相关。P300潜伏期测定是公认的能反映认知功能变化并能作为抗痴呆药物临床疗效评价的一种客观手段,其测定结果也从电生理角度证实了慢性低灌注大鼠认知功能的损害。行为学及P300潜伏期测定结果均证实盐酸多奈哌齐对慢性低灌注所造成的认知功能损害有肯定的防治作用,这一作用可能与其抑制胆碱酯酶后脑组织中乙酰胆碱浓度升高有关。是否与其直接增加脑血流或激活胆碱乙酰转移酶有关还有待深入研究。 第二部分:老化血管性痴呆大鼠模型的制作 目的:改良血管性痴呆大鼠模型,制作老化血管性痴呆大鼠模型,使其更接近人类血管性痴呆的病理生理特点,更有效地用于研究。 方法:采用D-半乳糖(D-gal)注射4周造成大鼠老化,并在此基础上行双侧间隔72小时结扎颈总动脉,观察双侧颈总动脉结扎24小时后大鼠血脑屏障的开放情况。六周后成模,观察成模大鼠脑内有无梗死灶形成,同时检测大鼠水迷宫试验、事件相关诱发电位潜伏期,海马区锥体细胞和突触素密度。 结果:改良大鼠模型的死亡率较小(17%),水迷宫试验显示模型组大鼠较正常组大鼠认知功能有显著的损害(P<0.05),P300测定结果也从电生理角度证实了模型组大鼠认知功能的损害(P<0.05)。海马区锥体细胞排列紊乱,数目明显减少(P<0.05),突触素密度也明显下降(P<0.05)。TTC染色结果证实该模型大鼠脑内未见明显梗死灶,伊文斯蓝染色结果说明模型大鼠血脑屏障在双侧颈总动脉结扎后24小时无明显开放情况。 结论:D-gal加双侧间隔颈总动脉结扎法制作老化血管性痴呆大鼠模型是成功的,且明显降低了双侧颈总动脉同时结扎所致血管性痴呆模型的死亡率,复制了更接近人类血管性痴呆病理生理特点的大鼠痴呆模型,为今后研究血管性痴呆发病机理及药物治疗提供了良好的平台。同时发现该模型大鼠在双侧颈总动脉结扎后24小时血脑屏障无明显开放情况。 第三部分:同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗老化血管性痴呆大鼠的实验研究 目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSC)移植治疗老化血管性痴呆模型大鼠后其认知功能的改变及脑内组织形态学变化。为骨髓间充质干细胞移植治疗血管性痴呆提供实验依据。 方法:分离培养鉴定BMSC后,以PBS将细胞调为1.0×10~6个细胞/μl的悬液备用。采用立体定位注射法在老化血管性痴呆模型大鼠脑内双侧侧脑室下区(SVZ区)移植5.0×10~6个细胞,各组大鼠每日接受5-溴脱氧尿核苷(BrdU)腹腔注射持续六周。六周后比较各组大鼠水迷宫试验及P300潜伏期的差异;BrdU免疫组织化学染色法观察各组大鼠SVZ区细胞增殖情况;HE染色法观察CA1区锥体细胞数目及形态学变化;突触素免疫组织化学染色法观察CA3区突触素密度改变。 结果:治疗组ERP试验及水迷宫试验均显示大鼠认知功能有明显改善(P<0.05),从行为学及电生理角度证实了BMSC移植治疗对血管性痴呆大鼠认知功能的保护作用;治疗组大鼠SVZ区细胞增殖较对照组明显增多(P<0.05);CA1区锥体细胞排列较对照组整齐,数目较后者明显增多(P<0.05);CA3区突触素密度也较对照组显著增多(P<0.05)。 结论:BMSC移植治疗脑梗塞模型的有效性已为许多研究者所公认,但对于老化血管性痴呆模型大鼠的作用却鲜见报道。本实验证实BMSC移植入老化血管性痴呆大鼠SVZ区后,能明显改善大鼠认知功能,原因可能与脑组织功能重塑有关。这种重塑涉及锥体细胞形态结构及数目的改变,同时也和脑内突触重塑密不可分,但重塑的始动因素尚有待进一步研究。 第四部分:骨髓间充质干细胞移植治疗老化血管性痴呆大鼠的机制研究 目的:研究骨髓间充质干细胞(BMSC)移植后老化血管性痴呆大鼠认知功能改善的可能机制。 方法:分离培养鉴定BMSC后,用Hochest33258将细胞标上蓝色荧光,PBS将蓝色荧光细胞调为1.0×10~6个细胞/μl的悬液备用。采用立体定位注射法在老化血管性痴呆模型大鼠脑内双侧SVZ区移植5.0×10~6个荧光细胞,六周后采用免疫荧光染色法观察BMSC在大鼠脑内的分布及分化情况,同时采用RT-PCR检测移植区NGF-mRNA的表达。 结果:带蓝色荧光的BMSC移植入脑六周后可见BMSC在脑组织中围绕侧脑室周边分布,明显勾勒出侧脑室形状,同时可见细胞向外较大幅度扩散。在SVZ区和皮质区均可见分化为神经元和胶质细胞的BMSC。相比于对照组,NGF-mRNA的表达在BMSC治疗组有明显的升高(P<0.05)。 结论:BMSC与宿主脑组织相互联系,通过分泌NGF,促进自身及神经干细胞分化等机制促使老化血管性痴呆大鼠脑组织的功能重塑从而最终改善了认知功能。


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