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分子印迹技术及其在环境雌激素监测中的应用研究

江明  
【摘要】: 环境雌激素是一类具有干扰人类和其他动物内分泌、影响生育能力的有毒有机污染物,其一般以痕量、超痕量存在于环境中。目前对环境中痕量雌激素类污染物的检测一般需要繁琐、耗时的样品预处理过程,如液-液萃取等。为提高样品预处理的效率,固相萃取技术已经广泛应用用环境雌激素类污染物的检测中。固相萃取具有溶剂使用量少、处理效率高、操作简单、易于自动化、可处理大量样品等优点,明显简化了样品预处理过程,已广泛应用于样品预处理中。但普通固相萃取方法缺乏选择性,因此在吸附浓缩环境中痕量污染物的同时,其他高浓度的污染物也会同时被萃取下来,影响了样品预处理的效率,降低了其在环境痕量污染物预处理中的应用价值。为提高固相萃取的选择性,利用抗原-抗体间特异性分子识别能力的免疫吸附(immunosorbents,IS)也已经应用于样品预处理中,IS处理后的样品几乎没有其他干扰物的干扰,极大地提高了对痕量污染物的检测灵敏度,但由于抗体作为蛋白质分子,对检测条件的耐受差,特别不能耐受有机溶剂,因此在实际应用中受到限制。 分子印迹(molecular imprinting)是人工制备对某一特定分子(称为模板分子或印迹分子)具有选择性识别能力的聚合物的技术,所得到的聚合物称为分子印迹聚合物(Molecular imprinted polymers,简称MIPs)。MIPs可高特异性结合模板分子,并可分辨手性异构体,也被称为‘人工抗体’。由于其物理性质稳定,耐有机溶剂和酸碱,在较广的热范围内性能仍保持稳定,在复杂环境中痕量有机污染物的分离检测等方面有具有广阔的应用。 本文以环境雌激素中的双酚A为代表分子,通过优化双酚A分子印迹聚合物的制备条件,以离线和在线模式固相萃取和检测环境中的双酚A,首次实现了以离线模式检测猪尿、人血清、虾、水中痕量的双酚A,并建立了在线模式中以一个MIPs填充柱直接富集和检测水样中的超痕量双酚A的新方法。 1、以沉淀聚合法合成了双酚A分子聚合物,并探讨聚合条件对合成聚合物形态及印迹效应的影响。结果表明: (a)不同比例的乙腈甲苯混合液为致孔剂对合成的聚合物形态有较大的差别。当以100%的乙腈为致孔剂时合成的聚合物形态较好,为单分散的微球,直径约为0.7um。随乙腈比例的降低,聚合物形态逐渐由球形微球过渡到不规则的颗粒。聚合物性能评价表明100%的乙腈为致孔剂时合成的聚合物虽然其吸附能力不是最强,但有最优的选择性。 (b)以不同体积的乙腈为致孔剂合成的聚合物形态有区别。乙腈体积较小时合成的聚合物形态不规则;而体积较大时合成的微球粒径太小,不利于固相萃取和色谱填充的应用。 (c)引发剂的含量和聚合的温度对聚合反应速度有影响,但对聚合物的形态和印迹效应无影响。 (d)以功能单体MAA和4-VP合成的聚合物形态一致,但碱性的功能单体4-VP合成的聚合物有更大的结合能力和选择性。 (e)模板分子双酚A的使用量对合成微球的形态无影响,但可影响印迹效应。随着双酚A用量的增加,聚合物的结合能力和选择性增加。 2、以合成最优的双酚A分子印迹微球固相萃取检测人血清、猪尿、自来水和虾中痕量的双酚A。优化了平衡、上样、洗脱和清洗步骤,得到最优的离线固相萃取条件:以5ml 3:1的甲醇:乙酸、5ml的甲醇、5ml的乙腈和5ml的蒸馏水分别平衡固相萃取柱,以5ml的水样上样,以1ml的乙腈洗脱和以3ml的甲醇清洗。在最优的固相萃取条件下,在2-20μmol/L的范围内固相萃取柱能选择性的识别、俘获和富集水中的双酚A,回收率在94.03%-105.3%间,RSD低于94.03% to 105.3%。在最优的固相萃取条件下,检测加标的人血清、猪尿、自来水和虾的回收率分别为65.80%, 82.32%, 76.00%和75.97%。相对于C18固相萃取柱,双酚A分子印迹柱处理后的液体用HPLC检测有更优的基线、分离效果和回收率。双酚A分子印迹聚合物微球可离线富集各种环境和生物样品中痕量的双酚A,在双酚A检测中具有实际的应用意义。 3、以所合成的最优双酚A分子印迹聚合物微球填充50mm×46mm色谱柱,通过大体积(40ml)直接进样,首次实现以一个MIP柱直接富集和检测复杂水样中的超痕量待分析物。对于加标蒸馏水,检测的线性范围为0.1-100 nmol/L(RSD小于9.6%)。在0.1-10nmol/L范围内对加标的自来水和湖水,RSD小于8.9%,回收率在96%-101.8%间。当40ml的水样直接进样时,本方法的富集倍数为10000。双酚A分子印迹聚合物微球HPLC柱可以直接分离、富集、检测水中痕量双酚A。建立了一种新的检测环境中痕量双酚A的方法。


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