淫羊藿甙对人工关节假体松动的作用及其分子机制

【摘要】： 目的:分别从细胞水平、分子水平及动物实验来探讨淫羊藿甙对假体松动的防治作用及其机制。 方法:1细胞水平:(1)探讨Ti微粒对体外培养的新生大鼠成骨细胞凋亡的影响及淫羊藿甙对其保护作用。取体外培养的大鼠成骨细胞,一组加入0.1%(体积比)的Ti微粒混悬液,另一组为淫羊藿甙共培养后的成骨细胞加0.1%(体积比)的Ti微粒混合培养,并于培养后24小时后用流式细胞仪检测成骨细胞的凋亡情况,透射电镜观察成骨细胞凋亡的超微结构变化。Ti微粒可诱导成骨细胞凋亡;用淫羊藿甙处理3天后的成骨细胞可部分对抗Ti微粒致细胞损伤作用。淫羊藿甙对Ti微粒诱导的成骨细胞凋亡具有部分保护作用。(2)观察淫羊藿甙对Ti微粒刺激单核细胞分泌IL-1?、IL-6、PGE2、TNF的影响。分离培养兔外周血单核细胞,分成4组:D组:Ti微粒刺激组,培养细胞中加入体积比为0.1%的Ti微粒。A组:D+10mg/ml的淫羊藿甙。B组:D+1mg/ml的淫羊藿甙。C组:D+0.1mg/ml的淫羊藿甙。用放射免疫测定法测量各上清中PGE2及TNF含量。用酶联免疫吸附试验测定各上清中IL-1β及IL-6含量。 2分子水平:研究淫羊藿甙对体外培养的大鼠成骨细胞OPN mRNA和Ⅰ型胶原表达的影响。从新生的SD大鼠的颅骨中,通过酶消化法分离出成骨细胞,放置于MEM培养基中培养,其形态通过倒置显微镜观察,并通过ALP染色加以鉴定。成骨细胞采用24孔培养板,实验分四组进行,分别设为A,B,C,D,每组6孔。A,B,C组分别用终浓度为0.1mg/ml,1mg/ml,10mg/ml的淫羊藿甙注射液进行干预,均在第5d提取总RNA,进行RT-PCR扩增。D组用α-MEM培养基培养,不用药物干预,于第5d提取总RNA,进行RT-PCR扩增。其对于成骨细胞增殖和分化的影响通过MTT比色实验、BGP含量的放免法检测以及用荧光二抗的免疫组化实验测定Ⅰ型胶原的表达来进行;用RT-PCR技术分别检测各组细胞的OPNmRNA的表达并进行定量分析。 3动物实验将30只成年新西兰兔随机分成三组。分阳性对照组、阴性对照组和用药防治组,各10只,雌雄各半,手术将两枚骨圆针自膝关节打入股骨胫骨行模拟膝关节假体置换,6周后阳性对照组和用药防治组向膝关节注射钛微粒悬液,阴性对照组注射生理盐水。用药防治组隔日注射淫羊藿甙1mg/膝,其余两组不与任何药物自由饮水摄食。16周后处死动物,用1ml生理盐水灌洗关节腔,收集关节液,离心取上清液,测上清液中IL-1?和TNF含量;取股骨下段作脱钙切片,HE染色后光镜下观察假体周围的病理变化。股骨及胫骨连同植入物取出后,在相同条件下(片距70CM,暴光时间5S)摄取X线正位照片,选用胫骨侧摄片输入计算机图象分析系统,定量分析胫骨侧植入物周围3mm厚度骨组织密度值[灰度值],进行比较。 结果:1.(1)Ti微粒可诱导成骨细胞凋亡;用淫羊藿甙注射液处理3天后的成骨细胞可部分对抗Ti微粒致细胞损伤作用。(2)和D组比较,A、B、C三组各与假体松动相关细胞因子含量均明显下降,且与药物浓度呈负相关。2.淫羊藿甙注射液对体外培养的大鼠成骨细胞OPN mRNA表达有明显促进作用,其作用强度随浓度而改变。3.和阴性对照组、用药防治组比较,阳性对照组中检测的IL-1β和TNF明显增高,用药防治组和阴性对比组比较无显著差异,两组胫骨灰度值无显著差异。 结论:淫羊藿甙对Ti微粒诱导的成骨细胞凋亡具有部分保护作用。可以降低假体周围炎性细胞因子的含量,促进成骨细胞基因表达,从而防治假体松动的产生。