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线虫中细胞分泌特性和蛋白质功能的研究

葛茜  
【摘要】: Caenorhabditis elegans(C. elegans,线虫),一种体长仅1 mm的土壤线虫,最早被英国科学家西德尼·布雷纳作为一种模式生物,用于研究发育和遗传学。 线虫是一种非常理想的遗传学研究模型。首先,它的基因组已经被完全解析,具有5对常染色体和一对性染色体。其次,它生活史短,个体小,可以自体受精,可以方便快捷地进行正义、反义遗传筛选;第三,易于用各种遗传学技术对其进行操作和研究。 基于线虫在多方面的优势,我们希望建立起一套线虫培养、操作的实验平台,尝试在线虫中开展细胞分泌特性和相关蛋白质功能的研究。 我们介绍了线虫培养过程中的各项操作方法。在实验室内,线虫可以在琼脂平板上进行培养,以大肠杆菌OP50为食。线虫雌雄同体共有959个体细胞,胚胎发育的细胞谱系已经完整地被描绘出来。而且,关于线虫302个神经元的位置、形态等也了解得比较清楚。 因此,我们通过线虫胚胎细胞原代培养技术,成功地在体外培养了多种神经细胞和肌肉细胞,并对其形态特征进行了观察和分析。 然后,我们选择了tph-1::GFP融合蛋白特异标记的虫系GR1366进行胚胎细胞的体外培养,得到了有荧光标记的线虫咽部NSM神经元。NSM神经元主要分泌的神经递质是5-HT。利用全细胞膜片钳和膜电容检测技术,记录了NSM神经元上的通道电流,该电流表现出明显的外向整流的特性。利用光解释放钙离子刺激,首次在体外培养的线虫细胞上记录到细胞分泌引起的膜电容增加,增加量平均在10 fF左右,具有良好的信噪比。采用碳纤电极安培测量技术,记录到NSM在高钾刺激下5-HT的电流信号。 在本文中,我们还进行了线虫基因突变库的构建,采用TMP和紫外照射,对大量的线虫进行随机突变。突变库建成之后,可以选择感兴趣的基因,特别是在细胞分泌过程中起作用的基因,设计相应的PCR反应的引物,通过一系列的筛选,即有可能从突变库中发现相应的突变等位基因。利用突变的线虫个体,就可以从单细胞水平对分泌特性和动力学过程进行分析,也可以从行为学深入研究基因和蛋白质的关系。


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