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线粒体膜ATP敏感钾通道在缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖/凋亡失衡中的作用

胡红玲  
【摘要】: 研究背景 迄今为止,肺动脉高压和肺心病的发病率和死亡率仍然居高不下,严重威胁着人类的健康。缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是最常见的类型,其发病机制目前尚未完全阐述清楚,其中缺氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary artery vasoconstriction,HPV)和缺氧性肺血管重建(hypoxic pulmonary vascular remodeling)是被认为是其两大主要的病理生理基础。目前认为,缺氧引起的肺血管收缩并非完全依赖于血管内皮细胞,血管平滑肌细胞也参与了肺血管收缩反应。在影响血管张力的各种因素中,血管平滑肌细胞钾通道和细胞内钙离子发挥着十分重要的作用。研究表明缺氧可抑制肺动脉平滑肌细胞钾通道的活性,引起肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)去极化,达到一定阈值后,电压依赖性钙通道开放,引起细胞内钙离子浓度升高,作为重要的第二信使,钙离子促使肺动脉平滑肌细胞收缩、增殖和迁移,也可激活各种蛋白激酶和转录因子,进一步引起缺氧性肺血管收缩和肺血管重建,最终导致肺动脉高压。 有一系列研究表明线粒体膜上ATP敏感的钾通道(MitoK_(ATP))能保护缺血缺氧心肌细胞免受氧化应激的伤害。Takashi等证实线粒体膜上ATP敏感的钾通道的开放能减少心肌细胞缺血/再灌注损伤时的凋亡标记物(细胞色素C的释放,Caspase活性,线粒体膜电位的改变等等)。Akao和他的同事们也研究了mitoK_(ATP)在凋亡中的作用,他们发现线粒体膜上ATP敏感钾通道的开放能抑制H2O2诱导的新生大鼠心肌细胞的凋亡。线粒体mitoK_(ATP)通道的开放为什么能起到保护心肌细胞的机制还不十分清楚,但是目前有三种假设解释mitoK_(ATP)通道与心肌细胞之间的联系:1)线粒体钙离子摄取的下降,Holmuhameclov等证实线粒体mitoK_(ATP)通道的开放能够降低线粒体钙离子摄取的程度。2)线粒体基质肿胀和ATP合成的改变,mitoK_(ATP)的开放能引起线粒体基质肿胀,并激活呼吸链产生更多的ATP,支持心肌细胞的恢复。3)氧自由基(ROS)水平的改变,在心肌细胞的保护中,氧自由基是一把双刃剑。预处理阶段产生的ROS是具有保护作用的,但是在再灌注阶段产生的ROS是有害的。mitoK_(ATP)通道的开放能引起预处理期保护性ROS水平的增加,和再灌注期产生的ROS水平的降低。 尽管这些研究表明线粒体mitoK_(ATP)通道在心血管细胞的增殖凋亡中起很重要的作用,但是线粒体mitoK_(ATP)通道在肺血管中的作用很少有人研究,线粒体mitoK_(ATP)通道是否与缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖/凋亡失衡有关以及其机制目前还没有相关报道。线粒体mitoK_(ATP)通道对动物和人的肺动脉平滑肌细胞增殖/凋亡平衡的调节是否具有一致性也还没有相关报道,但是由于进行人肺血管的体外和体内的实验研究是比较昂贵的和具有局限性的,因此对比动物实验和以人为实验对象的实验是否具有一致性,从而决定是否以动物实验代替以人为实验对象的实验,对以后的实验研究是具有重要意义的。 第一部分线粒体膜ATP敏感钾通道在缺氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖/凋亡失衡中的作用 分题一线粒体膜ATP敏感钾通道对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞细胞内细胞色素C分布的变化及细胞增殖中的作用 目的:研究线粒体膜上ATP敏感的钾通道(mitoK_(ATP))和线粒体膜电位(Δψ_m)在缺氧影响大鼠肺动脉平滑肌细胞内细胞色素C在细胞浆和线粒体内分布的变化及以及其引起细胞增殖变化中的作用,旨在探索缺氧性肺动脉重建和肺动脉高压形成的发生机制,为寻找新的防治方法提供试验依据。 方法:获取大鼠正常肺组织,分离出肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)进行常氧或慢性缺氧培养。将标本分为六组:①正常对照组;②MitoK_(ATP)阻断剂5-HD组;③MitoK_(ATP)开放剂Diazoxide组;④慢性缺氧(CH)组;⑤CH+5-HD组;⑥CH+Diazoxide组。利用激光共聚焦显微镜(Leica SP-1 USA)成像检测线粒体膜电位,线粒体/胞浆成分分离试剂盒(BioVision)分离线粒体和胞浆成分后,Western blot法检测两者细胞色素C,流式细胞仪检测细胞周期和MTT法检测细胞增殖情况。 结果:①Diazoxide作用24h后,与正常对照组比较,R-123荧光强度明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,细胞呈增殖明显增多、凋亡明显减少,与正常对照组相比较均P0.05;而5-HD作用24h与正常对照组比较,上述指标无明显变化, P0.05;;②慢性缺氧24h,结果与Diazoxide组相似,与正常对照组比较,R-123荧光强度明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,细胞呈增殖明显增多、凋亡明显减少,与正常对照组相比较均P0.05;;CH+Diazoxide组,与缺氧组比较, R-123荧光强度明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,细胞呈增殖明显增多、凋亡明显减少,与正常对照组相比较均P0.05; CH+5-HD组,与缺氧组比较,R-123荧光强度明显减弱,线粒体膜电位部分消失,细胞胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显升高,细胞增殖明显减少、凋亡明显增多,与正常对照组相比较均P0.05。 结论:本实验结果显示,缺氧可以引起MitoK_(ATP)的开放以及m的去极化,并进而抑制了细胞色素C从细胞线粒体释放到细胞浆,抑制线粒体凋亡途径,从而参与并影响了肺动脉高压的发生发展。 分题二线粒体膜ATP敏感钾通道对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞氧自由基的变化及细胞增殖中的作用 目的:研究线粒体ATP敏感性钾通道和线粒体膜电位(Δψ_m)在缺氧影响大鼠肺动脉平滑肌细胞细胞内氧自由基的变化及细胞增殖中的作用,旨在探索缺氧性肺动脉重建和肺动脉高压形成的发生机制,为寻找新的防治方法的提供试验依据。 方法:获取大鼠正常肺组织,分离出肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)进行常氧或慢性缺氧培养。将标本分为六组:①正常对照组;②MitoK_(ATP)阻断剂5-HD组;③MitoK_(ATP)开放剂Diazoxide组;④慢性缺氧(CH)组;⑤CH+5-HD组;⑥CH+Diazoxide组。利用激光共焦显微镜(Leica SP-1 USA)成像检测线粒体膜电位,荧光染色检测细胞内氧自由基含量,流式细胞仪检测细胞周期和MTT法检测细胞增殖情况。 结果:①Diazoxide作用24h后,与正常对照组比较,R-123荧光强度明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞内氧自由基含量明显增加,细胞呈增殖明显增多、凋亡明显减少,P0.05;而5-HD作用24h后,上述指标与正常对照组相比较,均无显著性差异, P0.05;②慢性缺氧24h,结果与Diazoxide组相似,与正常对照组比较,R-123荧光强度明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞内氧自由基含量明显增加,细胞呈增殖明显增多、凋亡明显减少,P0.05;CH+Diazoxide组,与缺氧组比较, R-123荧光强度明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞内氧自由基含量明显增加,细胞呈增殖明显增多、凋亡明显减少,P0.05;CH+5-HD组,与缺氧组比较,R-123荧光强度明显减弱,线粒体膜电位部分消失,细胞内氧自由基含量明显下降,细胞呈增殖明显减少、凋亡明显增多,P0.05。 结论:本实验结果显示,Diazoxide能够通过开放线粒体膜上ATP敏感的钾通道,引起Δψ_m去极化,Δψ_m的变化影响细胞内氧自由基的含量,氧自由基作为信号分子影响肺动脉平滑肌细胞的增殖/凋亡的平衡。 第二部分线粒体膜ATP敏感钾通道在缺氧性人肺动脉平滑肌细胞增殖/凋亡平衡中的作用 分题一线粒体膜ATP敏感钾通道对缺氧人肺动脉平滑肌细胞细胞内细胞色素C分布的变化及细胞增殖中的作用 目的:为了探索线粒体ATP敏感钾通道(mitochondrial ATP-sensitive K+ channel, MitoK_(ATP))和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψm)在细胞缺氧信号传导中的作用以及在缺氧性人肺动脉平滑肌细胞细胞色素C在细胞内的分布及细胞增殖中的影响。 方法:本实验将人动脉平滑肌细胞进行常氧或24小时缺氧培养,并将标本分为六组:①对照组;②MitoK_(ATP)阻断剂5-HD组;③MitoK_(ATP)开放剂Diazoxide组;④24小时缺氧组;⑤24小时缺氧合并5-HD组;⑥24小时缺氧合并Diazoxide组。利用激光共聚焦显微镜(Leica SP-1 USA)成像法检测线粒体膜电位;线粒体/胞浆成分分离试剂盒(BioVision)分离线粒体和胞浆成分后,Western blot法检测两者细胞色素C;Western blot法检测细胞中caspase-9的蛋白表达量;MTT法及PI染色后流式细胞仪检测细胞增殖情况。 结果:①Diazoxide作用24 h后,R123荧光明显增强,细胞胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞呈明显增殖增多、凋亡减少,与正常对照组相比较均P0.05;而5-HD作用24 h与正常对照组比较,上述指标无明显变化, P0.05。②缺氧24 h后,结果与Diazoxide组相似,R123荧光明显增强,细胞胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞呈明显增殖增多、凋亡减少,与正常对照组相比较均P0.05;24小时缺氧合并Diazoxide组与缺氧组相比较,R123荧光明显增强,细胞胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞呈明显增殖增多、凋亡减少,P0.05;而24小时缺氧合并5-HD组与缺氧组比较,R123荧光明显降低,细胞胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显升高,caspase-9的蛋白表达显著增加,细胞呈明显增殖减少、凋亡增多,P0.05。 结论:缺氧可以引起MitoK_(ATP)的开放以及Δψ_m的去极化,并进而抑制了细胞色素C从细胞线粒体释放到细胞浆,抑制线粒体凋亡途径。 分题二线粒体膜ATP敏感钾通道对缺氧人肺动脉平滑肌细胞氧自由基的变化及细胞增殖中的作用 目的:研究线粒体膜上ATP敏感钾通道(MitoK_(ATP))开放剂Diazoxide和线粒体膜电位(Δψ_m)在缺氧影响人肺动脉平滑肌细胞细胞内氧自由基的变化及细胞增殖中的作用,探索缺氧性肺动脉重建和肺动脉高压形成的发生机制,为探索新的防治方法的提供试验依据。 方法:培养人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs),进行常氧或慢性缺氧培养。将标本分为六组:①对照组;②MitoK_(ATP)阻断剂5-HD组;③MitoK_(ATP)开放剂Diazoxide组;④慢性缺氧组;⑤慢性缺氧合并5-HD组;⑥慢性缺氧合并Diazoxide组。利用激光共焦显微镜(Leica SP-1 USA)成像检测线粒体膜电位,荧光染色检测细胞内氧自由基含量,免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、C-fos及C-jun的表达和MTT法检测细胞增殖情况。 结果:①Diazoxide作用24h后,与正常对照组(R123荧光强度、细胞内氧自由基含量、PCNA、C-fos、C-jun的蛋白的积光度值及MTT的A值分别为74.67±7.02、2771.69±48.66、42.55±1.97%、68.58±21.54、76.18±12.65及0.2368±0.013)比较,R-123荧光强度(105.45±4.38)明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞内氧自由基含量(3044.69±126.34)明显增加,PCNA(53.52±2.28%)、C-fos(164.47±53.47)及C-jun(130.25±10.39 )的蛋白表达明显增加,MTT的A值(0.3048±0.022)也明显增加,P0.05;而5-HD作用24h后,上述指标与正常对照组相比较,均无显著性差异,P0.05;②慢性缺氧24h,结果与Diazoxide组相似,与正常对照组比较,R-123荧光强度(95.24±12.92)明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞内氧自由基含量(3115.88±34.12)明显增加,PCNA(54.55±2.14%)、C-fos (160.95±47.49)及C-jun(127.87±17.44)的表达明显增加,MTT的A值(0.3282±0.078)也明显增加,P0.05;CH+Diazoxide组,与缺氧组比较, R-123荧光强度(126.47±7.63)明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞内氧自由基含量(3236.01±30.86)明显增加, PCNA (66.13±2.59%)、C-fos ( 370.65±90.85)及C-jun (275.97±49.77)的表达明显增加,MTT的A值(0.4398±0.023)也明显增加,P0.05;CH+5-HD组,与缺氧组比较,R-123荧光强度(70.69±3.73)明显减弱,线粒体膜电位部分消失,细胞内氧自由基含量(2863.08±132.06)明显减少,PCNA(43.48±1.23%)、C-fos (70.87±21.46)及C-jun (79.87±12.75)的表达明显减少,MTT的A值(0.2637±0.045)也明显减少,P0.05。 结论:Diazoxide能够通过开放线粒体膜上ATP敏感的钾通道,引起Δψ_m去极化,Δψm的变化影响细胞内氧自由基的含量,氧自由基作为信号分子影响肺动脉平滑肌细胞的增殖/凋亡的平衡,从而参与并影响了肺动脉高压的发生发展。


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