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Sonic hedgehog信号通路在胰腺癌发生发展过程中的作用机制研究

胡伟国  
【摘要】: Sonic hedgehog信号通路在胰腺癌发生发展过程中的作用机制研究 目的研究胚胎发育信号通路Sonic hedgehog(SHH)在胰腺癌中的作用及其生物学意义,探讨SHH与WNT/β-catenin和EGFR信号通路的关系,并通过特异性阻断SHH信号通路,观察对胰腺癌细胞的影响,探索胰腺癌靶向治疗的新方法。 方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、免疫荧光和免疫组化法分别检测胰腺癌组织和细胞系中SHH信号通路主要分子的mRNA和蛋白表达情况,分析其与WNT/β-catenin和EGFR信号通路的相关性及其意义;用SHH信号通路特异性抑制剂cyclopamine处理胰腺癌细胞系,或用野生型PTC1真核表达质粒转染细胞系后,观察对EGFR表达的影响;用不同浓度Cyclopamine单独或联合Iressa处理胰腺癌细胞系后,通过四唑盐(MTT)比色试验检测癌细胞增殖状况,用流式细胞仪检测各组的细胞周期和凋亡率;RT-PCR和Western blot检测下游基因Bcl-2和p21的表达。 结果SHH mRNA和蛋白在胰腺癌组织中呈高表达状态,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P0.05)。SHH蛋白表达与β-catenin和EGFR蛋白表达呈正相关关系,且与年龄、肿瘤大小、组织学类型和肿瘤部位等病理因素均无关(P0.05),而在不同淋巴结转移状况和TNM分期的病例组中,表达差异有统计学意义(P0.05)。用cyclopamine处理胰腺癌细胞系,或用野生型PTC1真核表达质粒转染细胞系后,EGFR的表达下调。 流式细胞术检测可见,野生型PTC1转染组的细胞凋亡率达24.5%,转染突变型PTC1组的细胞凋亡率达8.3%,与对照组相比明显升高(P0.01)。而转染空质粒组的凋亡率无明显变化。随着Cyclopamine单独或联合Iressa作用浓度增加和时间延长,对PANC-1, SUIT-2, ASPC-1细胞增殖的抑制作用逐渐增强;联合应用Cyclopamine和Iressa具有相加的抑制效果。Cyclopamine单独或联合Iressa使细胞周期阻滞在G0/G1期,细胞凋亡率增加。Cyclopamine可以使Bcl-2基因表达下调,并使p21表达上调。 结论SHH和WNT/β-catenin信号通路在胰腺癌组织中呈活化状态,二者之间的交叉对话对胰腺癌的发生发展可能起重要作用。SHH与EGFR信号转导通路关系密切。PTC1作为一种重要的抑癌基因对胰腺癌细胞体外作用有重要影响,其主要的机制可能是通过SHH/PTC1/Gli1信号转导通路,作用于下游效应分子EGFR,对其产生直接影响。SHH信号通路特异性阻断剂Cyclopamine通过影响Bcl-2和p21基因表达,导致细胞周期阻滞和促进细胞凋亡,发挥对胰腺癌细胞增殖的抑制效应,并且这种效应呈剂量依赖性。 第一部分 胚胎发育信号通路Sonic hedgehog在胰腺癌中的表达及意义 目的研究胚胎发育信号通路Sonic hedgehog(SHH)在胰腺癌中的表达及其生物学意义。 方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和免疫组化方法,检测Sonic hedgehog信号通路主要成分SHH、SMO和Gli1在胰腺癌组织及癌旁组织中的mRNA和蛋白表达情况。 结果78.9%(30/38)胰腺癌组织中检测到SHH mRNA表达;18.4%(7/38)癌旁正常组织SHH mRNA阳性。免疫组化结果显示: 84.2% (32/38)胰腺癌组织SHH蛋白呈阳性表达;癌旁胰腺组织SHH阳性率为21.1%(8/38)。两组差异有显著意义(P 0.01)。SHH蛋白表达与年龄、肿瘤大小、组织学类型和肿瘤部位等病理因素均无关(P0.05),而在不同淋巴结转移状况和TNM分期的病例组中,表达差异有统计学意义(P0.05)。胰腺癌组织中的SMO的mRNA表达是正常组织中的2.38倍,差异显著(p0.05);Gli1mRNA在胰腺癌组织中的表达与正常组织比较为2.21,显著差异(p0.05)。胰腺癌组织中SMO蛋白表达的阳性率为92.1% (35/38),癌旁正常组织中阳性率仅为18.4%(7/38),且与配对的癌旁组织相比,SMO在胰腺癌组织中均为高表达,两者比较差异有统计学意义(P0.05)。胰腺癌组织中Gli1蛋白表达的阳性率为为86.8% (33/38),癌旁正常组织中阳性率仅为13.2%(5/38),且与配对的癌旁组织相比,Gli1在胰腺癌组织中均为高表达,两者比较差异有统计学意义(P0.05)。 结论SHH信号通路主要分子在胰腺癌组织中表达均增高,SHH信号途径可能在胰腺癌发生发展过程中起重要作用。 第二部分 Sonic hedgehog信号通路与WNT/β-catenin信号通路的相关性研究目的研究发育信号通路Sonic hedgehog(SHH)和WNT/β-catenin在胰腺癌组织中的表达及其相关性。 方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测胰腺癌组织及癌旁组织中SHH和β-catenin的mRNA和蛋白表达情况。 结果SHH mRNA和蛋白在胰腺癌组织中的阳性率分别为81.6%和79.6%,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P0.05)。β-catenin蛋白在胰腺癌组织中的阳性率为71.4%,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P0.05)。而β-catenin mRNA在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达水平均较低,差异无统计学意义(P0.05)。SHH和β-catenin蛋白表达与年龄、肿瘤大小、组织学类型和肿瘤部位等病理因素均无关(P0.05),而在不同淋巴结转移状况和TNM分期的病例组中,二者表达差异有统计学意义(P0.05)。配对资料的Spearman相关分析显示, SHH表达与β-catenin表达呈正相关关系(γ=0.352, P0.05)。 结论SHH和WNT/β-catenin信号通路在胰腺癌组织中呈活化状态,二者之间的交叉对话对胰腺癌的发生发展可能起重要作用。 第三部分Sonic hedgehog信号传导通路与表皮生长因子受体的关系 论文1 SHH在胰腺癌组织中的表达及其与表皮生长因子受体的关系目的研究Sonic hedgehog(SHH)在胰腺癌组织中的表达及其与表皮生长因子受体(EGFR)的关系。 方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法、免疫组化SP法分别检测胰腺癌组织及癌旁组织中SHH和EGFR的mRNA和蛋白表达情况。 结果SHH mRNA和蛋白在胰腺癌组织中的阳性率分别为81.6%和79.6%,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P0.05)。EGFR mRNA和蛋白在胰腺癌组织中的阳性率均为73.5%,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P0.05)。SHH和EGFR蛋白表达与年龄、肿瘤大小、组织学类型和肿瘤部位等病理因素均无关(P0.05),而在不同淋巴结转移状况和TNM分期的病例组中,二者表达差异有统计学意义(P0.05)。配对资料的Spearman相关分析显示, SHH表达与EGFR表达呈正相关关系(γ=0.232, P0.05)。 结论SHH和EGFR在胰腺癌组织中均呈高表达状态,二者之间存在密切的相关性,SHH和EGFR协同参与了胰腺癌的发生发展。 论文2 SHH/SMO在胰腺癌细胞系中的表达及其与EGFR的关系研究 目的研究胚胎发育相关信号通路Sonic hedgehog ( SHH )和EGFR在人胰腺癌细胞系PANC-1, SUIT-2, ASPC-1中的mRNA和蛋白的表达,以及shh信号通路抑制剂对EGFR表达的影响。 方法传代培养人胰腺癌细胞系,利用逆转录-聚合酶链式反应(RT—PCR)法分别检测SHH、SMO和EGFR在PANC-1, SUIT-2, ASPC-1中的mRNA的表达情况;Western blot和免疫荧光试验检测SHH和EGFR蛋白的表达;用特异性抑制剂cyclopamine处理胰腺癌细胞细胞后,观察EGFR表达的改变。 结果人胰腺癌细胞系PANC-1, SUIT-2, ASPC-1中均有不同程度SHH、SMO和EGFR表达,其中SUIT-2的表达最强;免疫荧光检测显示,SHH蛋白主要表达在胞浆中,而EGFR主要表达在胞膜上。用cyclopamine 2.5μM作用细胞系48h后,EGFR的mRNA和蛋白表达呈不同程度下调。 结论Sonic hedgehog ( Shh )和EGFR信号通路在胰腺癌细胞系中均呈活化状态,阻断SHH信号通路可以下调EGFR表达。 论文3胰腺癌细胞系体外转染PTC1对EGFR表达的影响 目的研究Hedgehog信号转导通路中抑癌基因PTC1体外对胰腺癌细胞生长的抑制作用,及对EGFR表达的影响。 方法用携带有野生型PTC1和突变型PTC1的真核表达载体及空载质粒转染SUIT-2细胞;用Western blot检测转染后PTC1蛋白表达的变化;检测转染后下游EGFR蛋白的表达。流式细胞技术检测细胞周期和细胞凋亡情况。 结果PcDNA3.1-PTC1wt、PcDNA3.1-PTC1mt及空载质粒转染细胞后,于荧光显微镜下观察,可见转染成功的细胞呈明显的绿色。转染野生型PTC1,突变型PTC1,空载质粒及未转染细胞1,2,3,4,5,6,7d后绘制细胞生长曲线明显可见转染野生型PTC1组细胞的生长可速度明显减慢,而未转染组和转染空载体质粒组无明显变化。转染野生型PTC1基因后,其表达明显升高,与转染突变型PTC1基因后有明显差异;转染野生型PTC1基因后,EGFR的表达明显下降,与其他3组有明显差异。流式细胞术检测可见,野生型PTC1转染组的细胞凋亡率达24.5%,转染突变型PTC1组的细胞凋亡率达8.3%,与对照组相比明显升高(P0.01)。而转染空质粒组的凋亡率无明显变化。 结论野生型PTC1转染胰腺癌细胞后,凋亡率有显著意义的改变,并可使细胞停滞于G1期。转染前后EGFR相应的改变说明,SHH与EGFR信号转导通路的关系密切。PTC1胰腺癌细胞体外作用的主要机制可能是通过SHH/PTC1/Gli1信号转导通路,作用于下游效应分子EGFR,对其产生直接影响。 第四部分 特异性阻断SHH信号通路对胰腺癌细胞系增殖和凋亡的影响及作用机制目的研究Cyclopamine单独或联合Iressa对胰腺癌细胞系PANC-1, SUIT-2, ASPC-1增殖和凋亡的影响及其作用机制。 方法不同浓度Cyclopamine单独或联合Iressa处理胰腺癌细胞系后,通过四唑盐(MTT)比色试验检测癌细胞增殖状况,并计算抑制率;用流式细胞仪检测各组的细胞周期;RT-PCR和Western blot检测下游基因Bcl-2和p21的表达。 结果随着Cyclopamine单独或联合Iressa作用浓度增加,对PANC-1, SUIT-2, ASPC-1细胞增殖的抑制作用逐渐增强;联合应用Cyclopamine和Iressa具有相加的抑制效果。Cyclopamine单独或联合Iressa使细胞周期阻滞在G0/G1期,细胞凋亡率增加。Cyclopamine可以使Bcl-2基因表达下调,并使p21表达上调。 结论Cyclopamine通过细胞周期阻滞和促进细胞凋亡,发挥对胰腺癌细胞增殖的抑制效应,并且这种效应呈剂量依赖性。


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