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1. 免疫磁性海藻酸钠复合微球的研制及在肿瘤早期诊断中的应用 2. BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定

李青  
【摘要】: 磁性高分子微球是通过适当的方法使高分子与无机物结合起来形成具有一定磁性及特殊结构的微球,其表面可赋予多种反应性功能基团,如-OH,-COOH和-NH2等,具有良好的生物相容性,通过与生物活性物质中的配基偶联,能够识别并结合相应的抗原、抗体或核酸等,然后可在外加磁场中进行分离富集。因此,磁性高分子微球在细胞分离、固定化酶、靶向药物和免疫检测等生物学领域有着广泛的应用前景。本课题旨在制备一种新型的纳米磁性复合微球,此种纳米级别的微球与普通的微球相比磁响应敏感度极高,同时具有超顺磁特性,在液相分散体中不易聚集、稳定性高,其比表面积非常大,负载蛋白质的能力强,将其制备免疫磁性微球可作为公共载体和分离工具。然后同免疫分析技术和化学发光技术相结合,设计开发出新一代磁性富集、检测系统和磁性化学发光免疫分析系统用于肿瘤早期诊断。此种检测方法的建立,将会带来巨大的社会效益和经济效益。 1.反相微乳-包埋方法制备磁性海藻酸钠复合微球 以正庚烷为油相,AOT为表面活性剂,海藻酸钠水溶液和碳包铁纳米颗粒混合作为水相,在高速搅拌和超声的条件下形成微乳液,加入氯化钙和环氧氯丙烷进行交联固化制备磁性海藻酸钠复合微球。系统地考察了反应过程中海藻酸钠的浓度、表面活性剂的浓度及搅拌速度对所制微球性能的影响,并对微球进行了初步的性能表征。实验证明此方法克服了目前磁性高分子微球单分散性差、磁响应性弱和粒径偏大的缺点,得到外观为球形、分散性好、平均粒径为279nm、具有强的磁响应性的磁性高分子微球。 2.在磁性微球表面交联抗体制备免疫磁性海藻酸钠复合微球 研究磁性复合微球表面化学基团的植入方法,在微球表面接入6-氨基正己酸“手臂”分子,将功能基团的手臂延伸6个碳原子长度,然后以两步法蛋白缩和的方法将羊抗鼠IgG二抗与微球联接,制备免疫磁性微球,并对抗体交联微球的反应条件进行优化。实验证明用此方法制备的免疫磁性微球抗体吸附量达111.2μg/mg,交联抗体后流式细胞术检测98.3%的磁性微球具有免疫活性。 3.建立肿瘤细胞磁性富集与检测系统,对肺癌患者外周血微转移癌细胞进行临床验证 制备羊抗鼠IgG二抗包被的免疫磁性微球,将免疫磁性分离技术与免疫细胞化学技术相结合建立肺癌细胞磁性富集与检测系统。鉴定该检测系统的特异性、灵敏性和稳定性,并进行肺癌患者外周血肿瘤细胞的临床验证。与单纯的免疫细胞化学检测技术及RT-PCR检测技术相比较,本论文建立的磁性富集与检测系统具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的特点,进行肺癌临床验证结果显示本检测系统检测率与RT-PCR检测技术所检测的结果相当,无显著性差异(p0.05),同时无假阳性结果出现,比单纯的免疫细胞化学检测技术检出率高,存在显著差异(p0.05)。 4.建立磁性化学发光免疫分析系统,应用于肿瘤标志物AFP的测定。 制备羊抗兔IgG二抗包被的免疫磁性微球,将免疫磁性分离技术与化学发光技术相结合,建立磁性化学发光免疫分析系统,优化检测系统的条件,鉴定其特异性、灵敏性和稳定性,并应用于患者外周血AFP的测定。实验证明本论文建立的磁性化学发光免疫分析系统具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的特点,进行患者外周血AFP的测定结果有很好的临床相符性。 本研究制备的新型纳米磁性复合微球,以碳包铁(Fe@C)纳米颗粒作为磁性内核,解决了氧化铁内核磁性能不够的难题,性能优良;在交联抗体时于微球与抗体之间连接一个手臂分子,避免了由于位阻效应导致的微球表面抗体与相应抗原结合不完全的弊端,更有利于微球功能的发挥。在此基础上,纳米磁性复合微球作为公共载体和分离工具应用于磁性富集与检测系统和磁性化学发光免疫分析系统,实验证明方便易行,具有广泛的应用前景。 目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21 (DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。 方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirA substrate peptide, BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Western blot鉴定表达产物的生物素化活性。 结果:成功地构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Western blot的结果显示,表达产物具有酶活性,能使HLA-A2-肽复合物生物素化。 结论:成功地制备了具有生物学活性的BirA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。


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