乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的研究

【摘要】： 第一部分糖尿病大鼠模型的建立 目的观察不同剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)对糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠成模率及4周存活率的影响。方法SD大鼠60只,随机分出12只作为对照组(N组),其余48只大鼠随机分为4组,分别腹腔注射STZ 50 ( A组)、55 ( B组)、60 ( C组)、65mg·kg-1 ( D组)诱发DM模型,比较各组1周后成模率和4周后存活率。结果以STZ 55mg·kg-1剂量腹腔注射复制DM大鼠模型的成模率高于50 mg·kg-1组(83.33% vs33.33%,P0.05),随STZ剂量的增加(STZ 60-65mg·kg-1)DM大鼠成模率增高,但存活率降低(83.33% vs 41.67%,P0.05)。结论综合考虑,STZ-DM大鼠造模宜选取STZ的最佳剂量为55mg·kg-1。 第二部分乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后心功能的影响 目的观察乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后心律失常和心功能的影响,探讨乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤的防治效果。方法72只大鼠先随机分为糖尿病组(36只,链尿佐菌素55mg·kg-1腹腔注射诱导)和非糖尿病对照组(36只)。动物分为正常假手术组(CS组, n=12)、正常缺血/再灌注组(CI/R组,n=12)、正缺血/再灌注+NAC(CN组, n=12)、糖尿病假手术组(DS组, n=12)、糖尿病缺血/再灌注组(DI/R组,n=12)、糖尿病缺血/再灌注+NAC组(DN组, n=12)。建模成功后,NAC处理组灌胃补充NAC(100mg·kg-1),每天2次,手术前1h再给NAC 150mg·kg-1腹腔注射。8周后,采用冠脉结扎及放松的方法复制心肌缺血/再灌注模型。观察标准肢体导联(Ⅱ)心电图、左心室发展压(LVDP)、收缩期和舒张期左心室内压的最大变化速率(±dp/dtmax),采血测肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-8(IL-8)含量,心肌组织匀浆检测丙二醛(MDA)含量。结果(1)基础状态下,糖尿病组与正常组相比,心功能降低(P0.05);TNF-α和IL-8含量高于正常组(P0.05)。(2)缺血/再灌注后, CN组和DN组LVDP值和±dp/dtmax高于对应的CI/R组和DI/R组,而上述指标DN组低于CN组(P0.05);心律失常评分、CK-MB、MDA、TNF-α和IL-8低于对应的CI/R组和DI/R组(P0.05),而上述指标DN组高于CN组(P0.05)。DI/R组LVDP值和±dp/dtmax低于CI/R组,而心律失常评分、CK-MB、MDA、TNF-α和IL-8高于CI/R组(P0.05)。结论8周病程糖尿病大鼠基础心功能降低,炎症反应明显,而且缺血/再灌注后心功能受损程度比非糖尿病组严重;补充NAC既可以改善糖尿病大鼠基础心功能,减轻炎症反应,也可减轻心肌缺血/再灌注损伤的严重程度,改善心功能;但与正常大鼠补充NAC组相比,疗效降低。 第三部分乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后细胞凋亡的影响 目的本实验拟观察乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后导致的细胞凋亡的影响。方法72只大鼠先随机分为糖尿病组(36只,链尿佐菌素55mg·kg-1腹腔注射诱导)和非糖尿病对照组(36只)。两组大鼠再分别随机分为假手术组、缺血/再灌注组和缺血/再灌注+乙酰半胱氨酸治疗组(乙酰半胱氨酸100mg·kg-1,2次/d,手术前1h再给NAC 150mg·kg-1腹腔注射),每组12只。给予乙酰半胱氨酸8周后进行实验。以穿线结扎及放松左冠脉制备心肌缺血/再灌注模型,组织匀浆检测心肌组织还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的活性;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)和琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化两种方法检测心肌细胞凋亡并计算凋亡指数。结果(1)正常假手术组未见明显的凋亡,糖尿病假手术组出现少量的凋亡细胞,同时伴有GSH含量降低,GSSG含量和Caspase-3的活性升高(P0.05);(2)缺血/再灌注后,糖尿病和非糖尿病组均出现明显的心肌细胞凋亡,同时伴有GSH含量降低,GSSG含量和Caspase-3的活性升高,上述变化糖尿病组比非糖尿病组更明显(P0.05);(3)乙酰半胱氨酸干预的糖尿病和非糖尿病大鼠的心肌细胞凋亡均减轻,同时伴有GSH含量上升,GSSG含量和Caspase-3的活性下降,上述变化非糖尿病组比糖尿病组更明显(P0.05)。结论乙酰半胱氨酸干预可以通过提高心肌GSH含量、降低Caspase-3的活性减轻糖尿病和非糖尿病大鼠缺血/再灌注引起的心肌细胞凋亡,对缺血/再灌注心肌有保护作用,但糖尿病组的疗效低于非糖尿病组。 第四部分乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后低氧诱导因子-1α和血红素加氧酶-1表达的影响 目的观察乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血红素加氧酶-1 (HO-1)表达的变化。方法利用链脲佐菌素复制糖尿病大鼠模型,建模成功后,灌胃补充NAC(100mg·kg-1),每天2次,手术前1h再给NAC 150mg·kg-1腹腔注射。动物分为正常假手术组(CS组)、正常缺血/再灌注组(CI/R组)、正常缺血/再灌注+NAC组(CN组)、糖尿病假手术组(DS组)、糖尿病缺血/再灌注组(DI/R组)、糖尿病缺血/再灌注+NAC组(DN组),每组12只,共72只,8周后进行实验。采用冠脉结扎及放松的方法复制心肌缺血/再灌注模型,检测各组心肌梗死范围、HIF-1α和HO-1的mRAN和蛋白表达变化。结果非糖尿病假手术组检测不到HIF-1α和HO-1的mRAN和蛋白表达,糖尿病假手术组检测到少量HIF-1α和HO-1的mRAN和蛋白表达;但是糖尿病组心肌缺血/再灌注后HIF-1α、HO-1mRAN和蛋白表达低于非糖尿病组(P0.05),心肌梗死范围大于非糖尿病组(P0.05)。乙酰半胱氨酸干预可以部分恢复糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后HIF-1α和HO-1的mRAN和蛋白的表达,同时减少心肌缺血/再灌注引起的心肌坏死,但是疗效降低(P0.05)。结论糖尿病加重心肌缺血/再灌注损伤,其机制与糖尿病心肌缺血/再灌注后HIF-1α和HO-1mRAN和蛋白表达相对降低有关。补充NAC可以部分恢复糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后HIF-1α和HO-1mRAN和蛋白表达,有一定的治疗效果。