收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

黑曲霉脂肪酶的酶学性质、基因克隆与表达及结构预测

舒正玉  
【摘要】: 在利用sn-1,3位置选择性的脂肪酶催化植物油脂转变为质构脂质的同时,还可以获得绿色新型生物能源——生物柴油。开发此工艺路线,对于植物油脂深加工和提高产品附加值具有重要意义,但目前我国关于sn-1,3位置选择性脂肪酶和质构脂质的研究开发尚处于起步阶段。本实验重点立足于研究开发具有sn-1,3位置选择性的脂肪酶,以期为发展质构脂质奠定酶学基础。本论文的主要内容和结果如下: 筛选到一株热稳定、耐酸和高比活力脂肪酶产生菌株。以罗丹明B作为指示剂,利用选择性培养基,从油污土壤中筛选到一株胞外脂肪酶高产菌株,经形态学和ITS序列鉴定为黑曲霉,该菌株编号为F044。黑曲霉F044脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为73.71倍,活性回收率为33.99%。对纯化脂肪酶酶学性质的研究表明:该脂肪酶分子量为35~40 kDa,水解橄榄油的最适温度和最适pH分别为45℃和7.0,在60℃以下和pH2.0~9.0之间有很好的稳定性。该脂肪酶的水解活性对Ca2+表现出明显的依赖性,而Mn2+、Fe2+和Zn2+对水解活性则有显著的抑制作用。在最适条件下水解pNPP的Km和Vmax分别为7.37 mmol/l和25.91μmol/min.mg。其N-端的15个氨基酸残基序列为Ser(Glu/His)-Val-Ser-Thr-Ser-Thr- Leu-Asp-Glu-Leu-Gln-Leu-Phe-Ala-Gln。 首次克隆了黑曲霉脂肪酶基因。根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸残基序列,结合丝状真菌脂肪酶分子活性中心和第一个氧阴离子洞区的保守氨基酸残基序列,运用生物信息学方法,从NCBI核酸数据库中找到一个与黑曲霉脂肪酶基因同源的侯选基因A84689。根据该基因序列,设计引物直接PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl。anl全长1044 bp,含3个内含子,分别为54 bp,45 bp和51 bp,编码297个氨基酸(含信号肽27个氨基酸)。在基因水平上,anl与其它脂肪酶基因核苷酸序列没有任何同源性;在蛋白质水平上,anl编码的氨基酸序列与A. flavus, T. lanuginosus, P. allii脂肪酶氨基酸序列分别有40%、50%和40%的同源性。 首次实现了黑曲霉脂肪酶基因的异源表达。将黑曲霉FO44脂肪酶基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上,转化E. coli BL21(De3)。经IPTG诱导后,成熟黑曲霉F044脂肪酶的编码基因在宿主菌中大量表达,表达量为50 mg/g湿细胞,但均以无活性的包含体形式存在。利用Ni-NTA金属亲和色谱柱,一步纯化出N-端携带6×His标签的重组脂肪酶蛋白。通过大量稀释法和DEAE Sepharose Fast Flow柱层析法相结合的复性方法,变性后的纯化重组脂肪酶蛋白在体外实现再折叠复性。复活后的重组脂肪酶比活力为221.49 U/mg。 将N-端融合有6×His编码序列的成熟黑曲霉F044脂肪酶基因克隆到pPIC9K载体上,转化P. pastoris GS115。经甲醇诱导表达后,黑曲霉F044脂肪酶基因在P. pastoris GS115中实现了功能性表达,发酵上清液脂肪酶酶活为15.50 U/ml。利用Ni-NTA金属亲和色谱柱,一步纯化出N-端携带6×His标签的重组脂肪酶蛋白。SDS-PAGE电泳显示,P. pastoris GS115产生两种分子大小不同的重组脂肪酶蛋白。Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化出这两种重组脂肪酶蛋白,均有脂肪酶活性,其中分子量较小的重组脂肪酶蛋白水解橄榄油的比活力为812 U/mg。 首次尝试利用BioEdit、PSIPRED和SwissModel等软件或服务器对黑曲霉脂肪酶的一级结构、二级结构和三级结构进行了分析。分析结果显示,无论是在一级结构、二级结构还是三级结构上,预测的黑曲霉脂肪酶结构与丝氨酸水解酶结构均相吻合。预测的黑曲霉脂肪酶三级结构与黑曲霉阿魏酸酯酶三级结构在“盖子”结构区存在显著差异。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 彭仁;林金萍;魏东芝;;耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选和鉴定[J];江西师范大学学报(自然科学版);2011年02期
2 张敏;黎继烈;蒋丽娟;王卫;袁强;;脂肪酶产生菌的紫外诱变选育[J];河南科技学院学报;2009年04期
3 刘维英;韩亚杰;胡坤;代斌;;合成己酸乙酯脂肪酶产生菌的筛选及发酵条件的研究[J];生物技术通报;2009年03期
4 苏敏;唐良华;夏黎明;郑丹华;;Aspergillus sp.脂肪酶发酵条件优化及酶学性质的研究[J];生物技术;2005年06期
5 苗新宇;滕利荣;袁立佳;王贞佐;孟庆繁;高波;;提取脂肪酶的一种新方法——纳米机破碎法[J];吉林大学学报(理学版);2006年03期
6 谭珍连;梁静娟;庞宗文;覃晓娟;;原生质体紫外诱变选育白地霉GXU08脂肪酶高产菌株[J];生物技术;2007年02期
7 晋青波;张庆庆;汤斌;危勤涛;;紫外诱变原生质体提高脂肪酶活力[J];安徽工程科技学院学报(自然科学版);2008年01期
8 张庆庆;晋青波;危勤涛;;原生质体紫外诱变脂肪酶高产菌株[J];食品工业科技;2008年04期
9 杨建军;马晓迅;王贵军;;大孔树脂吸附固定化脂肪酶机理研究[J];西北大学学报(自然科学版);2009年02期
10 王静云;武秋娟;包永明;李小明;;产脂肪酶嗜碱细菌的筛选及酶学性质研究[J];生物技术;2010年06期
11 张清刚;冯慧;;粘虫脂肪酶和脂肪含量的试验研究[J];科学通报;1966年04期
12 石永芝,邹瑜,林建强;盐霉素高产菌株的筛选[J];黑龙江八一农垦大学学报;2005年04期
13 马歌丽;高建奇;张志刚;何万亮;;根霉脂肪酶产生菌筛选及发酵培养基研究[J];饲料工业;2006年22期
14 刘仁春;吴晓英;范一文;林影;;紫外诱变选育脂肪酶高产菌株及其酶学性质的研究[J];生物技术;2008年01期
15 闫丽娟;赵春雷;谢振荣;唐湘华;黄遵锡;;脂肪酶产生菌Aspergillus niger NJY-1的选育及鉴定[J];生物技术;2009年06期
16 杜凯;孙玉梅;曹方;王珊;王潇磊;;活性炭粒度与吸附条件对脂肪酶固定化的影响[J];大连工业大学学报;2010年02期
17 禹邦超,刘德立;油菜幼苗酯酶同工酶和脂肪酶对热休克的反应[J];华中师范大学学报(自然科学版);1992年01期
18 李品周;施碧红;施巧琴;;脂肪酶稳定性研究[J];化学与生物工程;2006年12期
19 袁红玲;汤鲁宏;许正宏;陶文沂;;产有机相催化酯合成活性的脂肪酶菌株的筛选[J];微生物学通报;2007年01期
20 阮振华;王栋;徐岩;;华根霉胞内脂肪酶同功酶酶学性质研究[J];微生物学通报;2007年06期
中国重要会议论文全文数据库 前7条
1 闫丽娟;贺胜英;唐湘华;李俊俊;黄遵锡;;黑曲霉NJY-1脂肪酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
2 郭建林;马恒甲;王友慧;叶金云;陈建明;潘茜;沈斌乾;;水温对瓯江彩鲤消化酶的影响[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
3 翁少萍;章之蓉;黄晖;谢瑞生;何家林;;超声处理水、磁场处理水和激光处理水对过氧化氢酶、脂肪酶及胰蛋白酶活力的影响[A];首届粤港生物物理学术研讨会论文集[C];1999年
4 高顺宾;吴天星;;L-肉碱对生长肥育猪消化酶活力的影响[A];第四届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2002年
5 刘宁;赵谋明;汪勇;付敏;;磷脂酶Lecitase~ Ultra的固定化、结构表征及性质研究[A];管产学研助推食品安全重庆高峰论坛——2011年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨全国食品科学与工程博士生学术论坛论文集[C];2011年
6 谭崇桂;冷向军;李小勤;粟雄高;刘波;柴仙琦;;饲料中添加艾佐迈对南美白对虾生长性能及抗病力的影响[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
7 林岗;饶小珍;陈宁;郭世群;许友勤;;龟足成体的五种消化酶活力[A];中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 彭仁;耐有机溶剂脂肪酶的筛选、重组表达及其催化特性研究[D];华东理工大学;2010年
2 陈美龄;全细胞脂肪酶生物催化剂的构建及其在生物转化中的应用[D];浙江大学;2012年
3 于珊珊;重组嗜热闪烁杆菌脂肪酶系的性质表征及嗜热磷酸三酯酶晶体结构解析[D];吉林大学;2010年
4 刘文山;脂肪酶在酿酒酵母中的表面展示研究[D];华中科技大学;2010年
5 苑博华;伯克霍尔德菌的筛选、鉴定及其发酵产低温脂肪酶的研究[D];江南大学;2010年
6 杨光;脂肪酶固定化的新方法研究及其应用[D];浙江大学;2009年
7 高楠;褶皱假丝酵母脂肪酶热稳定性改造的设计与抗氧化酶的人工模拟[D];吉林大学;2011年
8 孙宇飞;真菌疏水蛋白表面展示对毕赤酵母细胞疏水性及共展示南极假丝酵母脂肪酶B的影响[D];华南理工大学;2013年
9 徐同成;1,3-甘油二酯对2型糖尿病的影响及选择性水解甘油三酯sn-2位酯键酶基因的克隆与表达[D];浙江大学;2008年
10 薛继鹏;三聚氰胺、氧化鱼油和脂肪对瓦氏黄颡鱼生长和体色的影响[D];中国海洋大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王迪;发酵性丝孢酵母脂肪酶与蛋白酶发酵及性质的比较[D];大连工业大学;2012年
2 张瑜;超高压对脂肪酶活性的影响及其机制初探[D];江南大学;2012年
3 邓颖颖;黑曲霉脂肪酶的摇瓶发酵、性质及其合成月桂酸单酯的研究[D];江南大学;2012年
4 陈大伟;洋葱假单胞菌脂肪酶在非水相介质中构效关系的研究[D];华中科技大学;2012年
5 董恒涛;粗状假丝酵母脂肪酶的分离纯化水解乳脂的研究[D];华南理工大学;2010年
6 王金主;高产脂肪酶菌株的选育研究[D];济南大学;2011年
7 田野;假丝酵母99-125生产脂肪酶的发酵工艺研究[D];内蒙古农业大学;2011年
8 王颖;热稳定性脂肪酶生产菌的筛选、性质及其应用研究[D];兰州理工大学;2014年
9 周晶;一株脂肪酶产生菌的筛选鉴定、发酵条件优化及其酶学性质研究[D];中国计量学院;2012年
10 王世辉;微胶囊法固定脂肪酶及拆分手性胺的研究[D];吉林大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978