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草木樨抗炎活性物质及抗炎作用机理研究

陶君彦  
【摘要】: 草木樨(Melilotus suaveolens Ledeb)是豆科(Leguminosae)草木樨属(Melilotus)一年生或二年生草本植物,在我国资源分布丰富,民间常用于炎症相关疾病治疗,但少见其活性物质与作用机理的研究报道。鉴于此,本文对草木樨抗炎物质基础、作用机理进行了系统研究,并对草木樨活性物质的提取工艺及生物转化进行了探讨,为揭示民间植物药草木樨抗炎作用机理提供了理论与技术基础。 以LPS刺激RAW264.7细胞为体外炎症细胞模型,实时荧光定量PCR测定TNF-a mRNA变化为评价指标,首先采用系统溶剂法将药材乙醇总提取物按照溶剂极性大小制备成石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水4个溶剂部位。对乙醇总提取物以及4个溶剂部位提取物进行了抗炎活性评价。结果显示除水溶性部位提取物之外其他提取物均具有类似地塞米松的抗炎作用。进一步对具有抗炎活性的石油醚、乙酸乙酯部位提取物进行化学成分研究,从中分离鉴定出5个化合物:香豆素、东莨菪内酯、滨蒿内酯、木犀草素和5,7,4′-三羟基-6,3′-二甲氧基黄酮。其中除香豆素外,其他4个化合物均首次从该植物发现,滨蒿内酯(6,7-dimethylaesculetin, Scoparone)和5,7,4′-三羟基-6,3′-二甲氧基黄酮为首次从该属植物发现的成分。 以LPS刺激RAW 264.7细胞为体外细胞炎症模型,采用双抗体夹心ELISA法、蛋白印染法、实时荧光定量PCR、免疫组化等多种方法,对具有抗炎活性的不同极性溶剂部位提取物及香豆素进行了抗炎作用机理研究,结果显示不同极性溶剂部位提取物与香豆素作用机理类似,即通过抑制NF-КB活性来显著性降低促炎细胞因子IL-6、IL-1β、NO及促炎介质COX-2、iNOS的生成;同时增加抗炎细胞因子IL-10和抗炎细胞介质HO-1的生成;HPLC指纹图谱研究结果表明香豆素可能是其中一种主要抗炎物质。 以香豆素为对照,建立了药材薄层鉴别和含量测定方法。香豆素在第3期(8月5日至8月15日)药材中含量最高,果实部位香豆素要高于同期茎干香豆素含量;HPLC指纹图谱分析结果显示果实、全草、茎干3个不同药用部位有12个相同的共有峰,8个相同的特征指纹峰。 优选了药材抗炎有效部位群制备工艺,并建立质量标准评价方法。药材最佳提取工艺:取草木樨药材粗粉,加50%乙醇回流提取3次,每次提取1.0h,加醇量依次为20倍、15倍、12倍。纯化最佳工艺:选用YWD07D1型大孔吸附树脂,上样药液浓度为200g药材/L,树脂柱径高比为1:7,药材和树脂用量比为7:1。上样后先用3倍柱体积去离子水洗脱,再用3倍柱体积80%乙醇洗脱。收集80%乙醇洗脱液,50°C减压浓缩,总有效部位以香豆素计含量达到50%以上。同时采用TLC、HPLC等手段建立了提取物质量标准评价方法,显示该工艺稳定可行。 以发酵过程中香豆素含量变化为指标,以草木樨药渣为对照,对Schizophyllum sp.(DS1)、Fomitopsis sp.(S1B)、Myrothecium sp.(MY)等9种药用真菌发酵草木樨药材中香豆素含量变化进行了初步研究。结果显示不同菌株发酵药材的物质变化规律不同。菌株Myrothecium sp.发酵过程中能够合成微量香豆素。


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