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Tritordeum组织特异性启动子的克隆

涂知明  
【摘要】: 启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要元件。一些基因只能在特定的组织中表达,就是依赖于组织特异性启动子的功能。无启动子转化策略是一种非常有效的内源启动子的捕获方法,将一个带有UidA基因的无启动子的质粒通过基因枪转化进tritordeum材料中,得到了一批转基因植株。并通过UidA基因的组织化学定位法来判定转基因材料中UidA基因的遗传和表达情况,特别是组织特异性启动子的遗传稳定性。对转基因材料和对照材料的不同组织经X-gluc显色检测UidA基因的表达,包括根、茎、叶和花的各个部分(颖片、外稃、内稃、心皮、花药原基、花粉粒等)的表达情况,成功获得了分别标定有花药原基组织特异性启动子、短细胞特异性启动子、花粉粒特异性启动子和内源广谱启动子的阳性植株。 为更明确这些材料的遗传表达特异性,对筛选的这些材料的阳性植株进行了连续的遗传稳定性分析,并进一步用PCR和RT-PCR技术分析UidA基因在不同组织中的分布和发生转录的情况,筛选出了供试材料。用CTAB法提取各种材料叶片的总DNA作模板,在花药原基组织特异性启动子被捕获的材料中,上游使用水稻花药启动子分离的引物P1:5′CACGTAGTTCAATTACAGTTC3′,以UidA基因的部分序列为下游引物P2 : 5′ACACAAACGGTGATACGTACACT3′,通过PCR扩增获得UidA基因的上游序列,获得一条长667bp的目的片断,分析发现含有部分UidA基因的序列和一段UidA基因的上游旁侧序列,该序列中具有植物启动子的一些必备元件,包括TATA框,GC框,CAAT框等启动子元件,初步断定它是一段花药组织特异性启动子序列。 首次在植物中采用碱性磷酸酶标记DNA制备分子探针。酶在苯醌作用下与单链DNA联结,形成DNA和酶的共价复合物,即酶标探针,此探针通过分子杂交与待测DNA结合,再与酶的底物作用显色,很快便能观察结果。用此探针检测乙肝病人血清中的HBV DNA及转基因植物中的UidA基因,点杂交和Southern杂交结果表明,所合成的酶标探针具有快速、准确、安全而经济的优点。 还对三种不同的大肠杆菌(DH5α,TG1和XL1 blue)高效感受态细胞的制备和保藏及转化方法进行了深入的研究。将普通的细菌转化方法做了三种改进:首先是将CaCl2溶液改为TB溶液;其次是将培养基由LB换成S.O.C;再就是在转化过程中加入DMSO或PEG8000。改良的细菌转化方法能大幅提高转化效率。


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