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白地霉Y162脂肪酶基因克隆与表达

阎金勇  
【摘要】: 从自然界中分离脂肪酶生产菌株,克隆并表达脂肪酶基因,丰富了脂肪酶基因资源,为脂肪酶的开发与应用奠定了基础。本文从四川泸州油污土壤中分离到一株脂肪酶酶活力较高的真菌。应用通用引物ITS1与ITS4从该菌中扩增出376bp的rDNA ITS序列(登录号EF159152),序列比对表明:该菌株与Geotrichum sp. TUGM12的rDNA ITS序列(登录号AY787702)有97%的同源性,结合形态学鉴定为白地霉,命名为白地霉Y162。基本酶学性质研究表明:该菌株所产脂肪酶最适温度40℃,最适pH9.0;35℃以下,pH6.0~8.5范围内该脂肪酶较稳定;Ba2+对酶活力有显著促进作用;Hg2+、Ag+、EDTA、SDS对酶活力有强烈抑制作用;K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+对酶活力有轻微促进作用;Mn2+、Cu2+、Fe3+对酶活力有一定程度的抑制作用。 以提高产酶量为目的,借助SAS9.0统计软件对G. candidum Y162液体发酵产脂肪酶的条件进行了优化。首先采用Plackett-Burman设计对影响产酶因素的效应进行评价,筛选出具有显著效应的黄豆粉、玉米浆和发酵时间三个最重要的因素。用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,得出黄豆粉、玉米浆最佳浓度分别为2.51%,2.12%,最佳发酵时间101.97h。优化后液体发酵液中脂肪酶活力提高到21.75 U/mL,比初始酶活力9.60 U/mL提高了2.27倍。 借助生物信息学,对已克隆的地霉属脂肪酶全长基因序列进行同源比对,根据保守序列设计引物,在基因组DNA水平上,于国内首次克隆了G. candidum Y162脂肪酶基因(登录号DQ841279)。G. candidum Y162脂肪酶基因全长1692bp,编码包括19个氨基酸信号肽在内的563个氨基酸。成熟的脂肪酶基因编码544个氨基酸,与NCBI GenBank中已报道的地霉属脂肪酶氨基酸序列(登录号AB000260)有86%的同源性。 将该基因克隆到pPIC9K表达载体上,转化毕赤酵母GS115,实现了脂肪酶的功能表达。发酵上清夜中SDS-PAGE检测到60KDa的脂肪酶蛋白条带;摇瓶发酵96h后毕赤酵母分泌表达30.4 U/mL重组脂肪酶,接近国外白地霉重组脂肪酶表达水平。


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