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空心莲子草组织培养及干旱和盐诱导基因表达载体构建研究

罗才波  
【摘要】: 干旱是作物最普遍面临的逆境,盐渍对植物的危害包括离子毒害和类似干旱的渗透胁迫作用。干旱和盐渍对植物生长和农作物产量的危害超过其它自然灾害之和。分离和筛选抗旱抗盐相关基因,用于作物基因改良是传统方法之外增强作物逆境适应性的有效手段。空心莲子草(Alternanthera philoxeroides (Mart.) Griseb.)作为两栖植物和盐生植物,抗旱抗盐能力强,是研究植物抗逆机理的优良材料,也将是耐盐耐旱等基因的重要来源。此外,空心莲子草的环境净化和药用价值也吸引了人们越来越多的关注。 本文对空心莲子草的研究从两个方面展开:一方面,建立了空心莲子草离体再生体系,并通过正交设计试验探讨了组织培养的影响条件。结果显示:空心莲子草愈伤组织诱导率受外植体类型、初始暗培养时间和生长素2,4-D显著影响,且影响力依次升高。最佳愈伤组织诱导条件为:以幼茎段为外植体,在半固体MS培养基上添加浓度为0.5 mg l-1 6-BA, 1.0 mg l-1 2,4-D和30 g l-1蔗糖,温度控制在25±2°C,初始暗培养20天后,14 h/10 h光周期1500勒克斯光强下见光培养。最佳条件下,愈伤组织诱导率达90%以上。愈伤组织芽分化是空心莲子草组培的限制步骤,芽分化率受细胞分裂素6-BA和初始光照培养时间的显著影响。芽分化最佳条件是:在半固体MS培养基上添加浓度为2.0 mg l-1 6-BA, 0.5mg l-1NAA和30 g l-1蔗糖,温度控制在25±2°C, 14 h/10 h光周期见光培养。再生茎芽生根显得容易,6-BA(≤2.0 mg l-1)与NAA(0.01~0.5 mg l-1)搭配,在半固体MS培养基见光培养可以获得97%的生根率。在以上条件下,空心莲子草三个月左右可以实现离体再生。空心莲子草组织培养是研究其抗盐抗旱分子机理的基础,同时也是为增强该材料环境净化、药用价值等优良性状进行转基因研究的前提。 另一方面,构建干旱和盐胁迫相关基因序列的表达载体。包括构建EST序列S2910(Genebank序列号:DQ492290.1)植物反义表达载体:pBI121-S2910,和基因序列D2714(Genebank序列号:DQ985704.1)毕赤酵母表达载体: pGAPZα-D2714。这些序列由课题小组高建明博士通过DDRT-PCR技术从干旱和盐胁迫的空心莲子草中分离得到。表达载体构建旨在下一步鉴定这些基因序列的功能,筛选有价值的抗旱抗盐基因。


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