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铜锌超氧化物歧化酶的核酸酶活性和DNA对其聚集的加速作用

蒋伟  
【摘要】: 肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种发病机理未知的较常见成人神经退行性疾病。铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)突变产生某种未知的获得性新功能被认为是导致ALS的原因之一,然而目前并不清楚SOD1在ALS发病过程中的作用。核酸作为贮存、传递遗传信息的物质,在生命活动中发挥极为重要的作用,轻微的损伤也会影响生物体的正常功能。由于目前已发现DNA损伤涉及某些神经退性行疾病,因此,本文从SOD1与DNA相互作用的角度,探讨SOD1的获得性新功能,取得如下主要结果: 1.利用紫外-可见吸收光谱和SOD1内源荧光猝灭的方法测定了SOD1对DNA的亲和性,利用琼脂糖凝胶电泳研究了SOD1和apoSOD1在二价金属离子存在下将超螺旋质粒DNA断裂为缺口形式和线性形式,以及将线性DNA断裂为小片段的性质,结果表明在外源二价金属离子存在下SOD1具有断裂DNA的核酸酶活性。稳态动力学实验结果显示SOD1和apoSOD1断裂DNA符合米氏动力学规律。与其他蛋白质和酶比较,发现SOD1这种核酸酶活性具有相对特异性,并非所有蛋白质都具有这种性质。SOD1的这种核酸酶活性是其固有的性质,与催化超氧阴离子歧化的活性中心无关。 2.利用生物化学方法研究了外源二价金属离子在SOD1核酸酶活性中所起的作用。基于“非等价多部位结合”模型,我们对金属离子滴定SOD1-DNA复合物的紫外-可见吸收光谱数据进行了拟合,结果显示复合物能够提供至少两个金属结合部位:一个强结合部位和一个弱结合部位,表明SOD1可能通过“双外源金属离子”的途径断裂DNA,即两个金属离子直接参与DNA断裂过程。另外,对pH-SOD1断裂DNA速率曲线进行拟合的结果显示催化过程中存在一个一般酸和一个一般碱。结合组氨酸特异性化学修饰结果,我们提出了SOD1在二价金属离子存在下水解DNA的模型:即通过组氨酸、金属结合水分子和双金属离子三者的协同作用水解DNA。 3.将正常SOD1暴露于酸性环境模拟金属结合区域SOD1突变体因突变导致的蛋白质稳定性降低、聚集倾向增强的性质,探讨了DNA加速SOD1聚集机理。利用直角光散射(RALS)、激光动态光散射(DLS)、原子力显微镜(AFM)、荧光显微镜系统研究了低pH下DNA加速SOD1聚集的性质,结果表明在酸性条件下,DNA可以作为模板加速SOD1形成聚集体。由低pH和与DNA相互作用导致的SOD1疏水性增强和DNA的模板富集效应是SOD1快速聚集的两个决定性因素。 4.利用透射电镜(TEM)、AFM、荧光显微镜系统研究了酸性条件下DNA加速SOD1形成的聚集体形态。在不同的DNA浓度下形成不同类型的聚集体(聚集单体,寡聚体,大聚集体等)。SOD1与DNA的比例影响聚集体的紧密程度,比例较高时DNA形成紧密的聚集态,比例较低时则形成较为松散的聚集态。结合聚集动力学等实验结果,证实DNA加速SOD1聚集的过程也是SOD1诱导DNA凝聚的过程,提出了SOD1与DNA相互作用导致SOD1聚集和DNA凝聚的反应模型。 5.利用酸性条件(pH4.0)对SOD1金属结合性质和结构稳定性的影响,模拟SOD1突变的效果,由RALS、DLS、荧光显微镜、AFM、TEM系统研究了ssDNA(24碱基)加速SOD1聚集的性质。结果表明ssDNA可以作为SOD1聚集的模板,促进纳米和微米级ssDNA-SOD1聚集单体、寡聚体、微聚集体和大聚集体快速形成。因酸性环境和ssDNA相互作用导致的SOD1疏水性增强和蛋白质局部浓度增大是SOD1快速聚集的决定性因素。ssDNA加速SOD1快速形成不溶性的大聚集体,有可能作为一种潜在的途径避免SOD1寡聚体累积产生的毒性,成为治疗或预防包括ALS在内的神经退行性疾病的药物。 6.利用琼脂糖凝胶电泳、RALS、DLS、TEM系统研究了近生理条件下DNA加速被氧化SOD1聚集的性质。结果表明,当SOD1与DNA共存于氧化环境中时,DNA显著加速SOD1聚集。该结果为DNA在酸性到中性的条件下均加速SOD1聚集的假设提供了证据,即氧化导致SOD1疏水性增强和DNA的模板富集效应是SOD1快速聚集的两个决定性因素。我们推测所有SOD1突变体都可能具有被DNA加速聚集的共同性质, SOD1与DNA异常相互作用加速蛋白质聚集的性质可能是SOD1导致ALS的一种获得性新功能。


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