收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

穿透素3在呼吸机所致肺损伤中作用机制的研究

舒化青  
【摘要】: 第一部分机械牵张A549细胞对细胞活性和穿透素3表达的影响 研究背景与目的大量资料证实了呼吸机所致肺损伤(VILI)与机械牵张应力有关,推测其可能机制是机械牵张对肺细胞的直接刺激触发、激活或启动细胞的牵张敏感基因高表达,其效应蛋白-细胞因子、炎症介质等大量产生,从而引发一系列的生物学反应,造成不同程度的生物学损伤。穿透素-3(PTX3)是一种急性期反应蛋白,也是一种炎症标志物,在炎症级联反应中均起着重要作用,并参与了机械牵张刺激引起的炎症反应过程,且它们基因启动子序列中均含有牵张反应元件,因而我们推测PTX3可能属于牵张敏感基因。本研究拟选择人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为研究对象,从细胞力学的角度,研究A549在体外周期性机械牵张作用下细胞凋亡和细胞因子分泌的情况,以期为VILI发生机制提供新的理论依据,并为从细胞水平研究VILI提供一个合适模型。同时以该细胞模型为基础在细胞水平观察体外机械牵张对A549细胞PTX3表达的影响。 方法本研究采用美国Flexercell公司生产的细胞柔性基底加载装置FX4000T,该系统是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜,形成负压而使培养膜拉伸应变,从而使黏附生长在膜上的细胞受到张力的作用,模拟机械通气对肺泡Ⅱ型上皮细胞的力学刺激,细胞所受力的大小正比于培养膜的牵拉幅度即应变率(%),加载程序由FX 4000计算机软件自动控制。对体外培养的A549细胞进行周期性牵张,观察不同机械力和不同牵张时间对细胞的影响。根据不同的处理方式分为静止对照组(C组)和机械牵张组(A组:6%应变率;B组:20%应变率),A组和B组其他加载方案均为:频率0.3Hz,周期性波形为方波,加载时间为1h、2h、4h和6h)。静止对照组:应用“Flexstop”,即一个橡胶塞塞在BioFlex培养板的下面,阻止真空抽吸柔性细胞培养膜。采用Annexin V/PI检测细胞凋亡活性,应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜进行检测,透射电子显微镜检测和Hoechst33258单染法荧光显微镜观察凋亡细胞核的形态变化。同时应用ELISA法检测A549细胞细胞因子TNF-α的分泌。用real-time RT-PCR检测肺泡上皮细胞PTX3 mRNA表达,Western blot检测PTX3蛋白水平。 结果与C组相比,牵张1h以上B组A549凋亡和死亡细胞百分比显著增加(p0.01),而A组无显著差异(p0.05),其差异主要是由于早期凋亡和晚期凋亡引起,而死亡细胞百分比没有显著差异(p0.05)。B组呈时间依赖性地引起A549细胞凋亡,同时也促进细胞因子TNF-α分泌。与C组相比,B组细胞PTX3 mRNA表达和蛋白产生呈时间依赖性增加,B组被牵张2h引起PTX3 mRNA和蛋白表达显著增加,分别增加6.25倍和2.58倍(p0.01),而A组细胞PTX3基因的表达没有影响。 结论体外过度机械牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞A549引起细胞凋亡和细胞因子TNF-α的分泌,并促进了PTX3表达,这可能在细胞力学水平为VILI提供了实验依据,同时也为后面从细胞水平研究VILI的发病机制提供了一个可行的模型。 第二部分有效干扰A549细胞穿透素3表达的siRNA的筛选 研究背景与目的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术作为特异抑制基因表达的重要手段,已被广泛用于基因表达调控和基因功能的研究及基因治疗。其基本原理是通过是21-23个核苷酸的小片段,即siRNA特异性识别其互补mRNA,促使其降解,使相关基因处于转录后基因沉默,从而使细胞表现出特定基因缺失的表型。目前制备siRNA的方法有体外化学合成、体外转录、体内表达载体合成等,其中体外化学合成具有方便简单的特点。基于上述考虑,本研究旨在筛选有效抑制PTX3表达的体外化学合成的siRNA,从而为进一步探索其功能,并作为某些疾病的治疗手段提供理论依据。 方法采用体外化学合成的方法,合成针对PTX3的siRNA各3对、阳性对照、阴性对照和荧光对照FAM-siRNA各1对,用脂质体2000转染A549细胞,用real-time PCR及Western-blot检测PTX3 mRNA和蛋白表达的水平。并转染荧光标记对照FAM-siRNA后,应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染效率。 结果脂质体2000将siRNA转染A549细胞的效率为89.18%±3.26%。与空白对照组相比,3对PTX3 siRNA均有效序列显著抑制了PTX3 mRNA和蛋白的表达(P0.01),其中针对PTX3最有效siRNA能将PTX3 mRNA抑制到3.41%,PTX3蛋白抑制到4.94%。而阴性对照组PTX3 mRNA和蛋白的表达均无显著差别(P0.05)。 结论化学合成的siRNA体外应用脂质体2000能高效转染A549,并筛选最有效干扰目的PTX3基因的siRNA,为进一步探索目的基因的功能提供理论依据。 第三部分干扰穿透素3表达对机械牵张引起A549细胞活性改变的影响 目的研究有效干扰PTX3基因表达对机械牵张引起A549细胞活性改变以及细胞因子释放的影响,探讨其在VILI中的可能作用。 方法体外培养于包被胶原基底膜collagenⅠ的BioFlex六孔培养板的人肺泡上皮细胞A549,随机分为空白对照组、静止对照组、牵张组、RNAi组、RNAi+牵张组。空白对照为未给任何干预正常培养细胞;静止对照组应用“Flexstop”阻止牵张;牵张组采用FX4000T细胞应变加载系统周期性牵张细胞,其方案为:应变率为20%,频率为0.3Hz,周期性波形为方波,加载时间为4h; RNAi组应用lipofectamineTM2000分别转染特异靶向PTX3的siRNA;RNAi+牵张组于牵张前12h转染特异靶向PTX3的siRNA。利用real time RT-PCR法检测A549细胞PTX3 mRNA表达的变化;Western blot检测分泌PTX3蛋白;Annexin V流式细胞术检测A549细胞凋亡;ELISA法检测培养基上清中细胞因子TNF-α水平。 结果与静止对照组相比,牵张组A549细胞PTX3基因和蛋白的表达显著上调,牵张组PTX3mRNA增加7.397±0.276倍(P0.01),牵张组和静止对照组PTX3蛋白分别为0.647±0.019和1.590±0.060(P0.01)。而与牵张组相比, RNAi+牵张组细胞PTX3 mRNA和蛋白表达显著抑制。与静止对照组相比,牵张组早期凋亡和晚期凋亡细胞百分比显著增加;而与牵张组相比,RNAi+牵张组成活细胞百分比明显增加(85.377%±1.395%和93.727%±0.492%,P0.01),凋亡细胞百分比明显降低。 结论周期性机械牵张可通过上调人肺泡上皮细胞PTX3基因和蛋白表达,导致肺泡上皮细胞凋亡增加和过度炎症反应,这一现象可能与VILI的发病机制有关。PTX3作为肺泡上皮细胞上表达的机械牵张敏感基因,从而积极参与了VILI的发病机制。 第四部大潮气量机械通气大鼠肺部穿透素3的表达变化 研究背景与目的呼吸机所致肺损伤(VILI)是机械通气的严重并发症之一。据统计,有22%~39%进行机械通气病人会发生VILI,死亡率高达15%~30%,严重影响患者预后。大潮气量机械通气时机械牵张应力作为一种炎症前期刺激,能通过特定的信号通路激起炎症级联反应,引起VILI。PTX3是新型的促炎症因子,在炎症级联反应中均起着重要作用,细胞水平研究结果显示,过度机械牵张能显著上调其表达,且基因启动子序列中均含有牵张反应元件,因而我们推测PTX3作为牵张敏感基因,可能在VILI的发病机制中起着重要作用。本实验拟研究大潮气量机械通气对大鼠肺部PTX3表达的影响。 方法48只健康成年雄性SD大鼠随机分成正常对照组(C组,n=16,保持正常自主呼吸)、保护性机械通气组(PV组,n=16,潮气量Vt:6ml/kg,PEEP=3~5cm H2O,呼吸频率为70次/分)、大潮气量机械通气组(HV组,n=16,Vt:20ml/kg,PEEP=0),呼吸频率为20次/分。其余通气参数均一致,即吸呼之比为1∶2 ,吸氧浓度FiO2为35%。颈动脉和颈内静脉切开置管,行监测、标本采集和液体及麻醉药的输注。持续检测HR、ECG、有创动脉血压(ABP)、直肠温度量监测。间断进行血气分析,计算氧合指数。机械通气4h后处死大鼠。(1)HE染色光学显微镜下观察各组肺组织病理学变化;(2)检测肺组织湿/干重比值(W/D);(3)检测肺泡灌洗液和血清中蛋白计算肺通透指数(LPI),ELISA法检测肺组织匀浆和肺泡灌洗液中TNF-α;(4)测定肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性;(5)TUNEL法检测肺细胞的凋亡;(6)real-time PCR检测大鼠的肺组织中PTX3基因mRNA的表达水平;(7)免疫组化法检测肺组织PTX3蛋白的表达;(8)Western Blot检测肺组织PTX3蛋白的含量。 结果(一)PV组与C组相比,肺损伤各项指标无显著改变。HV组通气4h PaO2显著降低(P 0.05),肺组织LPI、W/D和MPO活性均显著增加(P 0.05),组织病理学检测表现急性炎性损伤性改变。HV组大鼠肺组织匀浆和肺泡灌洗液中TNF-α含量显著大于C组和PV组(P 0.01),而C组与PV组无显著差异(P 0.05)。TUNEL法检测可见肺细胞凋亡改变。(二)与C组相比,HV组通气4h后PTX3基因mRNA和蛋白表达均显著升高,PTX3基因mRNA和蛋白分别增加3.493倍和3.799倍;而PV组PTX3基因mRNA和蛋白表达均无显著改变(P0.05)。 结论大潮气量机械通气能导致肺损伤,而且显著上调了PTX3基因mRNA和蛋白表达水平,这可能与VILI的发生密切相关。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 Rinaldo JE ,Rogers RM ,高诚;成人呼吸窘迫综合征:肺损伤及肺修复观念的改变[J];国际呼吸杂志;1983年01期
2 刘超,陈琳洁,王安潮;急性氨中毒肺损伤15例临床分析[J];蚌埠医学院学报;1995年06期
3 汪盛贤,刘宽宇,陈玉琼,陈志远,雷士泽;中性粒细胞的两种简易标记方法及在计量中的应用[J];西南国防医药;1996年02期
4 石铮,殷凤峙,黄鹤光,林永 ;重症急性胆管炎引发肺损伤时脂质过氧化作用的实验研究[J];中国普外基础与临床杂志;1996年04期
5 周继红;内皮素、内皮素受体与肺损伤[J];国外医学.骨科学分册;1996年02期
6 陈佰义,姜莉,赵洪文,吕长俊,侯显明;肺泡腔内纤维连接蛋白、透明质酸积聚于博莱霉素致肺损伤早期动态观察[J];中国医科大学学报;1999年05期
7 卢青,孙中吉;丹参对ARDS大鼠肺损伤的治疗保护和对肺泡巨噬细胞分泌细胞因子的调节作用[J];中国急救医学;1999年07期
8 王辉山,易定华,汪曾炜,徐鹏;间断给氧对兔体外循环中肺损伤的保护[J];第四军医大学学报;2000年05期
9 吕孝东!215004,刘根寿!215004,吴浩荣!215004,邢春根!215004,李军成!215004,陈易人!215004;急性胰腺炎大鼠氧自由基的变化与肺损伤的关系[J];中华普通外科杂志;2000年12期
10 陈建常,王乐农,史振满,卢开柏;丹参、甘露醇对肢体缺血再灌注所致肺损伤保护作用的比较[J];中国现代医学杂志;2001年11期
11 许峰;高浓度氧肺损伤研究进展[J];实用儿科临床杂志;2002年02期
12 项晓培,蔡皓东;SARS患者静脉营养管理的调研[J];药物不良反应杂志;2003年06期
13 刘巨源,刘瑞丽,海广范,朱命炜;维拉帕米对博莱霉素A_5所致大鼠肺损伤的防治作用[J];新乡医学院学报;2004年03期
14 马威,张良清,张森煌,谢谦;大黄素对大鼠重症胰腺炎肺损伤保护作用的研究[J];广东医学院学报;2005年05期
15 任斌辉,景华,李德闽,李忠东,罗立国,申翼,顾卫东,许飚,易俊;乌司他丁减轻体外循环肺损伤的临床研究[J];实用医学杂志;2005年15期
16 孙秀珍,张德信,刘昀;大剂量维生素C对急性肺损伤的保护作用[J];西安交通大学学报(医学版);2005年04期
17 周学武,尚涛,唐颖,杜少敏,冯丽艳;鼠羊水栓塞肺病理变化及补体作用的探讨(英文)[J];中国现代医学杂志;2005年18期
18 刘勇;王胜利;;中性粒细胞蛋白酶及其抑制剂与体外循环肺损伤[J];实用医学杂志;2006年20期
19 赵宏儒;;百草枯中毒致肺损伤12例临床分析[J];中国医药指南;2010年01期
20 龚明;马一盖;;硼替佐米治疗难治性浆细胞疾病导致的肺损伤[J];临床肿瘤学杂志;2010年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张明静;王兴勇;卢仲毅;;白藜芦醇甙对内毒素休克肺损伤大鼠TH1/TH2失衡的干预作用[A];2003年全国危重病急救医学学术会议论文集[C];2003年
2 陈海斌;王正国;周继红;杨志焕;刘伟雄;贺伟;李晓炎;宁心;;激波传播的三个时段在肺损伤中的作用[A];第十四届全国激波与激波管学术会议论文集(下册)[C];2010年
3 黄新莉;周晓红;范亚敏;凌亦凌;;硫化氢对脂多糖所致肺损伤的影响及机制研究[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
4 阚海东;宋伟民;蒋蓉芳;;室内常见气传真菌对动物肺损伤的实验研究[A];中国毒理学会第三届全国学术会议论文(摘要)集[C];2001年
5 门秀丽;张连元;孙树勋;;牛磺酸对大鼠肢体缺血再灌注致肺损伤病理形态学的影响[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
6 王辰;詹庆元;;呼吸机所致肺损伤与肺保护性通气策略[A];2003年全国危重病急救医学学术会议论文集[C];2003年
7 王鹏程;罗自强;汉建忠;刘惠君;;MK801对内毒素血症时小鼠肺损伤的保护作用[A];中南地区第六届生理学学术会议论文摘要汇编[C];2004年
8 夏照帆;马兵;卫伟;贾一韬;;活化素受体样激酶5活性抑制在炎性肺损伤发病机制中的意义[A];第五届全国烧伤救治专题研讨会烧伤后脏器损害的临床救治论文汇编[C];2007年
9 姜宏英;;呼吸机所致肺损伤大鼠模型病理学研究[A];第二十三届航天医学年会暨第六届航天护理年会论文汇编[C];2007年
10 于湘友;;体外循环肺损伤与其防治的研究进展[A];中国病理生理学会危重病医学专业委员会第八届全国大会暨中华呼吸病学会呼吸生理和重症监护学组年会论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 茹永新;红景天对博莱霉素诱导的大鼠肺损伤干预作用实验研究[D];天津中医学院;2004年
2 刘洪斌;急性出血坏死性胰腺炎肺损伤发病机制及中药治疗的实验研究[D];天津医科大学;2004年
3 申翼;基质金属蛋白酶-9与体外循环肺损伤的研究[D];第二军医大学;2005年
4 杨玉花;甲醛吸入染毒致大鼠肺损伤的蛋白质组学研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
5 董春山;异丙酚对机械通气肺损伤影响的动物实验研究[D];新疆医科大学;2006年
6 张馨木;重组人Elafin对实验性大鼠急性胰腺炎作用的研究[D];吉林大学;2007年
7 刘明东;JNK通路在急性胰腺炎相关性肺损伤的作用机制及丹参酮ⅡA的干预作用研究[D];南京中医药大学;2010年
8 左伟;核因子—κB活化对急性坏死性胰腺炎肺损伤作用的实验研究[D];中国医科大学;2003年
9 马宏博;扶正排毒液治疗内毒素休克肺损伤作用的研究[D];北京中医药大学;2003年
10 赖添顺;骨髓间充质干细胞治疗呼吸机所致肺损伤的动物实验研究[D];南方医科大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李存友;盐酸与胃蛋白酶单肺误吸导致对侧肺损伤的对比性研究[D];中国医科大学;2002年
2 马辉;氧化/抗氧化失衡在慢性阻塞性肺病患者肺损伤发病机制中的研究[D];天津医科大学;2006年
3 钟琳琳;生存素在急性出血坏死性胰腺炎合并肺损伤中的表达[D];中国医科大学;2006年
4 陈燕桦;体外循环肺损伤的研究现状[D];广西医科大学;2009年
5 陈瑞丰;胰炎合剂治疗大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤NF-κB活性的研究[D];河北医科大学;2003年
6 刘成军;基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在高氧肺损伤中的研究[D];重庆医科大学;2004年
7 何家庆;单侧胸部撞击致家兔对侧肺损伤的实验研究[D];第三军医大学;2003年
8 王海燕;TGF-β1信号通路对内毒素肺损伤中ECM重建紊乱的调控机制[D];广州中医药大学;2011年
9 胡洋;胚胎干细胞对博莱霉素所致小鼠肺损伤的治疗作用初探[D];苏州大学;2007年
10 聂川;未成熟新生鼠高氧肺损伤超微结构改变及TGFβ_1的表达[D];暨南大学;2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 曹志新 达娃旺杰;毒气吸入肺损伤[N];健康报;2004年
2 严佶祺;供肝热缺血时间延长可致肺损伤[N];中国医药报;2003年
3 琳琳;干细胞有望修复肺损伤[N];中国医药报;2002年
4 ;拉扎碱类药预防肺损伤研究近况[N];中国医药报;2003年
5 王雪飞 马威 王云彦;SARS病毒如何引发肺损伤[N];健康报;2005年
6 哈尔滨医科大学药学院博士 张荣衣晓峰 陈英云 整理;放射性肺损伤机制新解[N];健康报;2008年
7 吴一福;黄芩甙对胰腺炎肺损伤具有保护作用[N];中国医药报;2006年
8 吕乃群;抗菌药可造成肺损伤[N];卫生与生活报;2006年
9 李仁丰;一氧化氮可治重症非典[N];健康报;2003年
10 张中桥;深挖掘新发现[N];医药经济报;2001年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978