收藏本站
收藏 | 论文排版

蓝藻藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白生物合成的研究

苏平  
【摘要】: 蓝藻是光合作用微生物,在适宜水体中会大量生长繁殖,形成蓝藻水华。藻胆蛋白是藻类光合作用捕光复合物的功能组份,藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类同源蛋白家族。蓝藻体内,藻胆蛋白生物合成的最后一步为藻胆色素与脱辅基藻胆蛋白的连接,藻胆色素的正确连接一般都需要特异的裂合酶来催化完成。目前,已知藻红蓝蛋白裂合酶PecE/F催化藻蓝色素PCB异构化形成PVB并与脱辅基蛋白PecA连接;藻蓝蛋白裂合酶CpcE/F催化藻蓝色素PCB与脱辅基蛋白CpcA的连接。但是对于核膜连接蛋白ApcE、藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白中CpcB和PecB、变藻蓝蛋白APC各亚基的生物合成,目前还未见报道。本研究应用体外重组和大肠杆菌体内重组的方法,以鱼腥藻PCC7120为材料,对ApcE、CpcB、PecB以及APC各亚基的生物合成进行了研究。 研究了核膜连接蛋白脱辅基蛋白ApcE和ApcE(1-240)与PCB的体外重组。研究表明:ME是重组反应所必需的,4mol/L尿素提高了核膜连接蛋白重组产物的产率,蔗糖的存在有利于催化反应。体外重组最佳的反应体系是:20mmol/L磷酸钾缓冲液(简称:KPB),0.1mol/L NaCl,4mol/L尿素,200mmol/L蔗糖,0.1mmol/L ME, pH 7.2。重组色素蛋白LCM(1-240)经过Ni2+螯合亲和层析提纯后,紫外吸收和荧光光谱具有661nm/672nm的特征峰;其圆二色光谱的极值为662、604、383和347nm;通过光谱计算出重组产物LCM(1-240)的紫外可见吸收比、摩尔消光系数和荧光量子产率分别为4.1、93000 M-1 cm-1和0.43;以上均显示了特征藻胆蛋白的性质。LCM(1-240)的聚集状态分析显示,重组色素蛋白主要以二聚体的形式存在。同时我们研究了ApcE(1-240)与PCB反应的动力学参数,得到其Km=1.3μmol/L、Vmax=9.6nmol/L·s-1、kcat=9.6×10-4 s-1。LCM(1-240)的尿素变性和Zn电泳显示,His6-ApcE(1-240)与PCB的连接是正确的共价连接。 研究了藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白脱辅基蛋白CpcB(C155I)和PecB(C155I)与PCB的大肠杆菌体内重组和体外重组。本研究利用双克隆载体,将脱辅基蛋白CpcB(C155I)( PecB(C155I)、CpcB、PecB)、裂合酶CpeS、血红素氧化酶HO1、胆绿素还原酶PcyA在大肠杆菌中共同表达,重组后色素蛋白具有特征的紫外可见吸收和荧光光谱。其中,所得到的色素蛋白PCB-CpcB(C155I)和PCB-PecB(C155I)的特征峰分别为619nm/643nm和602nm/630nm。色素蛋白的酸性尿素变性实验表明,变性后紫外吸收峰的位置在662nm左右,证明所连接的色素为PCB。在紫外光的照射下色素蛋白可以产生Zn荧光,证明PCB与脱辅基蛋白是正确的共价连接。根据光谱所得到的一系列的光谱参数(可见紫外吸收比、荧光量子产率、摩尔消光系数)都显示了色素蛋白具有天然藻胆蛋白的性质。同时我们还利用胰蛋白酶进行色素蛋白PCB与CpcB(C155I)和PecB(C155I)的水解实验,水解后的色素肽的高效液相色谱与从天然鱼腥藻PCC7120中所得到的CpcB和PecB水解多肽的HPLC图谱相近,可以证明利用大肠杆菌体内重组所得到的色素蛋白具有天然藻胆蛋白的性质。另外,CpeS催化CpcB(C84A)和PecB(C84S)与PCB的连接时,没有正确的产物生成。以上研究均表明了CpeS可以催化CpcB(C155I)、PecB(C155I)、CpcB和PecB中Cys-84与PCB的偶联。参照CpeS催化CpcB(C155I)和PecB(C155I)与PCB的体外重组的最佳反应体系,将天然的CpcB(PecB)与PCB进行重组,得到的色素蛋白与PCB-CpcB(C155I)和PCB-PecB(C155I)相比,特征峰有2~3nm的红移。 研究了变藻蓝蛋白脱辅基蛋白ApcA、ApcB、ApcA2、ApcD、ApcF与PCB的大肠杆菌体内重组。本研究利用双克隆载体,将脱辅基蛋白ApcA(ApcB、ApcA2、ApcD、ApcF)、裂合酶CpeS、血红素氧化酶HO1、胆绿素还原酶PcyA在大肠杆菌中共同表达,重组后色素蛋白PCB-ApcA、PCB-ApcB、PCB-ApcA2、PCB-ApcD和PCB-ApcF具有特征的紫外可见吸收和荧光光谱,分别为618nm/642nm、612nm/640nm、622nm/642nm、650nm/663nm(602nm/635nm)和622nm/644nm。色素蛋白的酸性尿素变性实验表明,变性后峰的位置在660~664nm左右,证明所连接的色素为PCB。在紫外光的照射下色素蛋白可以产生Zn荧光,证明PCB与脱辅基蛋白是正确的共价连接。根据光谱所得到的一系列的光谱参数(可见紫外吸收比、荧光量子产率、摩尔消光系数)都显示了色素蛋白具有天然藻胆蛋白的性质。利用胰蛋白酶进行色素蛋白PCB-ApcA和PCB-ApcB水解实验,水解后的色素肽的高效液相色谱与从天然鱼腥藻PCC7120中所得到的APC水解多肽的HPLC图谱相似,证明利用大肠杆菌体内重组所得到的色素蛋白具有天然藻胆蛋白的性质。色素蛋白Zn电泳在紫外光的照射下可以产生Zn荧光,证明色素PCB与脱辅基蛋白是正确的共价连接。色素蛋白的圆二色光谱具有天然藻胆蛋白的性质,可见区CD显示的是与脱辅基蛋白所连接的色素的构象,分别在350nm和600nm左右有特征的吸收峰。紫外区显示的是色素蛋白多肽链的构象,其中PCB-ApcA、PCB-ApcB、PCB-ApcD和PCB-ApcF和其他藻胆蛋白一样是α螺旋,只有PCB-ApcA2比较特别是β折叠。通过对色素蛋白的质谱分析,可以证明藻蓝胆素是与脱辅基蛋白在Cys-82位连接。以上实验证明了CpeS可以催化以上五个变藻蓝蛋白亚基和PCB的正确连接。大肠杆菌体内重组产物PCB-ApcD存在两种光谱形式:PCB-ApcD600和PCB-ApcD650,经过初步鉴定推测与蛋白的聚集态有关。 研究了CpeS催化变藻蓝蛋白脱辅基蛋白ApcA、ApcB、ApcA2、ApcD、ApcF与PCB的体外重组的辅助因子和酶动力学。研究表明:KPB是比较适合的缓冲液,pH 7.2,NaCl的浓度在100mmol/L~200mmol/L,反应温度37℃。对于ApcA来说,Mg2+可以提高ApcA与PCB重组的效率,而对于ApcF和ApcD,Mg2+影响不大,ME对ApcD与PCB的重组产物的光谱形式有很大的影响,其他金属离子抑制了重组产物的生成,其他辅助因子对重组反应也没有很大的影响。因此,在ApcD和ApcF的体外重组中,不添加其它的辅助因子。通过对CpeS酶的动力学研究表明,酶的催化速度与只有单一的连接作用的藻蓝蛋白裂合酶CpcE/F相当,比具有异构作用的PecE/F略快一些。通过无His-tag的CpeS与脱辅基蛋白ApcA、ApcD、ApcF的体外重组,然后利用镍离子鳌合亲和层析提纯,得到较纯的PCB-ApcA、PCB-ApcD、PCB-ApcF,光谱以及通过光谱所计算出的参数显示与大肠杆菌体内重组所得到的产物性质相同,证明CpeS在一定的条件下也可以催化PCB与ApcA、ApcD、ApcF的连接。但是,在体外重组中,CpeS不能催化ApcB和ApcA2与PCB成功偶联。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前18条
1 刘锦玉,张季平,万柱礼,梁栋材,张建平,伍华菊;条斑紫菜变藻蓝蛋白立方晶系的初步晶体学研究[J];科学通报;1997年12期
2 孙德光;郭雅琳;章峰;尚孟慧;臧晓南;张学成;;重组藻蓝蛋白与水稻类囊体膜之间光能传递的初步研究[J];海洋湖沼通报;2021年01期
3 赵金梅;朱菁萍;王锋;周明;赵开弘;;层理鞭枝藻藻蓝蛋白β亚基的体内重组[J];武汉大学学报(理学版);2006年04期
4 王广策,周百成,曾呈奎;钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白能量传递模型的构建[J];科学通报;1996年08期
5 张群;;藻蓝蛋白制备关键技术研究[J];食品与生物技术学报;2021年06期
6 鲁轶男;张发宇;胡淑恒;汪家权;;巢湖蓝藻藻蓝蛋白稳定性的实验研究[J];合肥工业大学学报(自然科学版);2017年11期
7 郝帅;秦玉;王成涛;;功能食品藻蓝蛋白的生理活性研究进展[J];食品与生物技术学报;2017年12期
8 刘慧慧;姜良乾;王玉娟;刘国祥;姬欢欢;任俊逸;李冰;;藻蓝蛋白抗肿瘤的应用现状[J];肿瘤防治研究;2018年06期
9 夏冬;孙军燕;刘娜娜;刘冰;杜振宁;;藻蓝蛋白抗氧化作用及其药理活性研究进展[J];海洋科学;2015年07期
10 张晓平;李慧芬;黄润芸;田景振;;藻蓝蛋白抗肿瘤及其作用机制研究进展[J];医学研究杂志;2013年09期
11 夏安东,朱晋昌,蒋丽金,周映雪,刘慎新,张新夷;C-藻蓝蛋白的压力相关的荧光特性研究[J];科学通报;1992年11期
12 普毓明,蒋丽金,曾繁杰;一种简单、快速制备变藻蓝蛋白的新方法及坛紫菜中变藻蓝蛋白的某些性质的研究[J];科学通报;1986年04期
13 褚静;周小兰;王立芹;曹国芬;李腾;张海苗;;C-藻蓝蛋白对乳腺癌细胞的抗癌作用研究[J];基因组学与应用生物学;2020年02期
14 于淑坤;岳思君;李敏;徐小春;苏建宇;;钝顶螺旋藻藻蓝蛋白分离纯化[J];食品科技;2019年05期
15 王有朝;曹敏杰;苏文金;张凌晶;毛海燕;时超岚;刘光明;;R-藻蓝蛋白的分离纯化及抗食物过敏活性研究[J];集美大学学报(自然科学版);2013年04期
16 殷钢,刘铮,刘飞,李琛,丁富新,袁乃驹;钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究[J];清华大学学报(自然科学版);1999年06期
17 方光如,汪廷,黄丽敏;藻蓝蛋白的提取及其稳定性研究[J];江西农业科技;1987年S1期
18 邵思蜜;苏海楠;张熙颖;周百成;张玉忠;;光谱学方法对钝顶螺旋藻异藻蓝蛋白活性构象研究(英文)[J];光谱学与光谱分析;2010年06期
中国重要会议论文全文数据库 前20条
1 周明;李梅;武栋;赵开弘;;层理鞭枝藻藻蓝蛋白裂合酶基因的表达与酶活性研究[A];第四届中国酶工程学术交流讨论会论文集[C];2003年
2 刘畅;陈填烽;;藻蓝蛋白功能化纳米硒逆转棕榈酸诱导的β胰腺细胞凋亡的研究[A];中国化学会第十四届全国生物无机化学学术会议会议手册[C];2018年
3 江涛;张季平;常文瑞;梁栋材;;多管藻(Polysiphonia urceolata)R-藻蓝蛋白2.4分辨率晶体结构研究[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年
4 张季平;王新泉;李乐农;常文瑞;桂璐璐;郭宝江;梁栋材;;钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋白单斜晶系晶体结构研究[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年
5 毛海滨;李国富;阮翔;吴庆余;公衍道;张秀芳;赵南明;;强光对蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803中藻胆体的功能的影响[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年
6 张亚旗;赵雪;曾荣急;李桂玲;李健;;离子交换层析和凝胶层析结合法纯化钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白[A];中国食品科学技术学会第十五届年会论文摘要集[C];2018年
7 楼士林;章军;宋新强;徐虹;;蓝藻Synechococcus sp.PCC7942藻蓝蛋白基因插入突变及其对色素基团的影响[A];中国藻类学会第十一次学术讨论会论文摘要集[C];2001年
8 王有朝;刘光明;;藻蓝蛋白分离纯化及性质研究[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
9 何立明;郑树;郁琳琳;蔡心涵;;藻蓝蛋白对人大肠癌细胞株和S180小鼠移植瘤的光敏作用[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
10 部音利;冯亚非;;硒-藻蓝蛋白缀合物的抗肿瘤活性研究[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
11 部音利;冯亚非;;硒-藻蓝蛋白缀合物的抗肿瘤活性研究[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
12 武栋;朱菁萍;周明;赵开弘;;藻胆蛋白连接异构酶在色素蛋白重组中的作用研究[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年
13 张玉忠;周百成;曾呈奎;刘宁;庞世瑾;;海洋红藻R-藻胆蛋白的扫描隧道显微镜研究[A];第四届全国STM学术会议论文集[C];1996年
14 季宇彬;徐博慧;高世勇;;藻胆蛋白主要生物活性研究进展[A];全国第十一届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2009年
15 邱澄宇;杨远帆;倪辉;;鲍壳表层绿色物质的初步研究[A];中国科协2004年学术年会海南论文集[C];2004年
16 赵开弘;;藻胆蛋白连接/异构酶和藻胆蛋白生物合成[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年
17 蔡春尔;陈燕;何培民;;条斑紫菜藻胆蛋白提纯方法探索[A];中国蛋白质组学第三届学术大会论文摘要[C];2005年
18 杨春虹;Ruth Horn;Harald Paulsen;;叶绿素(a/b)捕光蛋白复合体(LHCIIb)可以从完全变性的脱辅基蛋白状态进行体外重组[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年
19 李月;邓迎峰;周明;赵开弘;;优化培养基增加层理鞭枝藻藻胆蛋白产量[A];第五届全国光生物学学术讨论会论文摘要集[C];2000年
20 孙力;孙岩;龚雪琴;陈礼学;王淑梅;;藻胆蛋白的应用[A];西部地区第二届植物科学与开发学术讨论会论文摘要集[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前12条
1 苏平;蓝藻藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白生物合成的研究[D];华中科技大学;2008年
2 姜良乾;藻蓝蛋白及靶向纳米微球C-PC/CMC-CD59sp的抗乳腺癌分子机制研究[D];青岛大学;2019年
3 关翔宇;藻蓝蛋白组合生物合成及蓝藻连接多肽生物进化研究[D];中国海洋大学;2008年
4 武栋;藻胆蛋白裂合酶性质及催化功能研究[D];华中科技大学;2005年
5 刁红丽;集胞藻藻胆蛋白降解的蛋白酶研究[D];华中科技大学;2011年
6 赵成;藻胆蛋白裂合酶CpcE/F和PecE/F的结构和催化机制研究[D];华中农业大学;2018年
7 赵丽;藻胆蛋白清洁分离纯化技术研究[D];哈尔滨工业大学;2015年
8 于平;极大螺旋藻藻蓝蛋白基因的克隆及其表达研究[D];浙江大学;2003年
9 李冰;钝顶螺旋藻/节旋藻藻蓝蛋白的提取纯化及抗肿瘤免疫效应研究[D];中国海洋大学;2006年
10 李文军;新型藻胆蛋白的制备及其在生物传感和染料敏化太阳能电池中的应用[D];中国科学院烟台海岸带研究所;2017年
11 华荣茂;体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建[D];西北农林科技大学;2021年
12 苏海楠;蓝藻与红藻中藻胆蛋白的活性构象研究[D];山东大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前20条
1 梁霄;C-藻蓝蛋白光学特性与生物活性的稳定性研究[D];广西大学;2020年
2 闫美宏;基于藻蓝蛋白为荧光探针检测重金属的方法及应用[D];哈尔滨工业大学;2017年
3 武康;柱色谱法纯化藻蓝蛋白的优化研究与机理分析[D];合肥工业大学;2019年
4 Kolawole Bienvenu Hanania E BONI;盐析法联合柱层析法纯化藻蓝蛋白的研究[D];合肥工业大学;2019年
5 莫柳达;螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化、荧光探针研制及其在快速检测中的应用[D];福州大学;2018年
6 汪琼;葛仙米基因组及其藻蓝蛋白基因的克隆与表达[D];湖北民族大学;2019年
7 沈向阳;钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化精制研究及应用[D];广西大学;2019年
8 张晓萌;粉末活性炭吸附法联合柱层析、超滤纯化藻蓝蛋白的试验比较研究[D];合肥工业大学;2018年
9 王胜楠;海生红藻多管藻R-藻蓝蛋白分离纯化及结构特性分析[D];烟台大学;2018年
10 苏雨;多种柱层析精致纯化藻蓝蛋白的研究[D];合肥工业大学;2018年
11 类成龙;蓝藻抗干扰原位检测的方法研究与系统设计[D];清华大学;2017年
12 冯玉杰;螺旋藻中藻蓝蛋白的提取与纯化[D];南昌大学;2013年
13 杨红;盐泽螺旋藻藻蓝蛋白β亚基在大肠杆菌中的重组生产及抗氧化性研究[D];南京林业大学;2018年
14 郭一洋;基于光学分类的太湖藻蓝蛋白反演[D];辽宁工程技术大学;2016年
15 朱孝晨;钝顶螺旋藻藻蓝蛋白与多糖的制备及生物活性研究[D];烟台大学;2018年
16 牛欣欣;藻蓝蛋白改善半乳糖致衰小鼠卵巢功能的转录组分析[D];内蒙古大学;2017年
17 徐润;钝顶螺旋藻藻蓝蛋白储存稳定性研究[D];天津科技大学;2017年
18 赵冰冰;巢湖水华蓝藻藻蓝蛋白提取纯化研究[D];合肥工业大学;2015年
19 洪博雯;重金属对藻蓝蛋白光合作用相关功能的毒性作用研究[D];哈尔滨工业大学;2019年
20 台丹丹;多管藻藻胆体中藻红–藻蓝蛋白复合体的分析[D];烟台大学;2021年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 本报记者 许帆婷;智能光谱分析为智慧石化“点睛”[N];中国石化报;2018年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978