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携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒对C型Niemann-Pick病小鼠的神经保护作用

魏佳军  
【摘要】: 第一部分利用Helper Free系统构建携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒及功能鉴定 目的 周期素依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinases, cdks)在多种神经变性疾病的发病中扮演着重要的角色。实验目的是为了探讨与cdks相关的基因治疗C型尼曼-皮克病的可能性,我们包装携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)。 方法 应用分子生物学技术构建生成pAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA表达质粒。用磷酸钙将该质粒和p-RC、p-Helper质粒共转染于AAV-293细胞中,包装生成携带cdc2-siRNA的rAAV (rAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA)。行Western Blot检测cdc2-siRNA对AAV-293细胞cdc2基因的沉默效果。 结果 DNA测序证明U6-cdc2-siRNA已成功构建到质粒pAAV-MCS-EGFP中。经72小时的包装,AAV-293细胞中可见EGFP的表达。rAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA感染AAV-293细胞后,经Western Blot检测显示AAV-293细胞中cdc2基因表达显著下调,这证明该重组腺相关病毒具有令人满意的基因沉默作用。 结论 这些结果表明该携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装获得成功。它具有有效沉默cdc2基因的作用,这将可能为C型尼曼-皮克病提供一种新的治疗手段。 第二部分携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒对C型尼曼-皮克病小鼠行为学的影响 目的 观察小脑注射携带cdc2-小干扰RNA(cdc2-siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)对C型尼曼-皮克病(NPC)小鼠行为学的影响。 方法 2周龄npc-/-小鼠经小脑注射携带cdc2-siRNA的rAAV,动态测量小鼠体重,并进行衣架悬挂试验及足印试验评估小鼠4到8周的运动能力。 结果 ①cdc2-siRNA组小鼠体重减轻明显延缓。 ②衣架悬挂试验显示cdc2-siRNA组小鼠运动缺陷明显改善。 ③足印试验显示cdc2-siRNA组相对步距(75.1%±8.6%)与对照病毒组及非手术组相比明显增加。 结论 小脑注射携带cdc2-siRNA的rAAV改善了npc-/-小鼠的行为学,有可能为NPC的治疗提供新的有效途径。 第三部分携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒对C型尼曼-皮克病小鼠神经病理的影响 目的 评估小脑注射携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(rAAV)对C型尼曼-皮克病(NPC)小鼠神经病理的影响。 方法 ①经小脑途径给2周龄npc-/-小鼠注射携带cdc2-siRNA的rAAV。 ②通过免疫组织化学、HE染色及免疫印迹方法评估注射携带cdc2-siRNA rAAV npc-/-小鼠的病理改变。 结果 ①携带cdc2-siRNA的rAAV在npc-/-小鼠脑中广泛表达。 ②携带cdc2-siRNA的rAAV明显减少npc-/-小鼠轴突球状体的数量、延缓浦肯野细胞的脱失。 ③携带cdc2-siRNA的rAAV能有效抑制cdc2、磷酸化的神经丝(由SMI31识别)、磷酸化的有丝分裂相关蛋白(由TG-3和MPM-2识别)及磷酸化的Tau蛋白(由PHF-1识别)的表达。 结论 小脑注射携带cdc2-siRNA的rAAV对npc-/-小鼠神经元细胞骨架病理具有保护作用,cdc2有可能成为NPC治疗的新靶点。


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