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力学负荷对体外培养软骨细胞及在体软骨的影响

李凯  
【摘要】: 第一部分力学因素对体外培养兔软骨细胞糖胺多糖合成的影响 实验一原代和传代兔关节软骨细胞糖胺多糖合成的动态观察 目的研究传代对体外培养兔关节软骨细胞糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)合成的影响。 方法1月龄新西兰兔5只,无菌手术切取双膝关节软骨,采用0.4%Pronase酶和0.025%Ⅱ型胶原酶消化分离关节软骨细胞,体外培养。待细胞融合时,换无血清培养液。于换液后12、24、36、48、60h分别抽取上清液测量GAG浓度。传代两次,重复上述过程。采用重复测量资料的方差分析检验P0、P1、P2代细胞上清液液GAG浓度的差异。 结果P2代以内,软骨细胞形态无明显变化,但P2代细胞内空泡状颗粒增多。传代后,细胞融合时间缩短,但是上清液GAG浓度随传代逐渐下降(P<0.001),且P0、P1、P2代之间两两比较差异有显著性(P<0.001)。换液60h后,P1代软骨细胞GAG浓度较P0代下降24%,P2代较P0代下降74%。换液后时间越长,上清液GAG浓度越大(P<0.001)。换液后时间与传代之间存在交互效应,时间越长,传代细胞与原代细胞上清液GAG浓度相差越大(P<0.001)。 结论在体外单层培养条件下,原代软骨细胞GAG合成能力最强,传代后很快大幅下降。细胞融合后连续检测上清液GAG浓度是研究软骨细胞分化的有效方法。 实验二高密度细胞培养对兔关节软骨细胞糖胺多糖合成的作用 目的观察不同接种密度下,软骨细胞合成糖胺多糖的能力。 材料与方法1月龄新西兰兔5只。采用0.4%Pronase酶和0.025%Ⅱ型胶原酶消化分离双膝关节关节软骨细胞,来源于同一只兔的软骨细胞分为两部分,一部分以2×104/cm2接种,传代时仍以相同密度接种。另一部分在细胞贴壁后,人工降低细胞密度至2×103/cm2培养。倒置显微镜下观察细胞形态和增殖情况。原代和传1代细胞于细胞融合后换液。换液后12,24,36,48,60h以改良Alcian blue染色沉淀法测定糖胺多糖质量浓度。 结果原代高密度培养组关节软骨细胞为多边形,轮廓清晰,三四天即可见集落形成,集落周边细胞较中心瘦长,为长多边形,传1代细胞形态无明显变化。低密度培养细胞早期散在分布,7d左右形成集落,细胞形态与高密度培养无明显差异。原代低密度培养软骨细胞长到融合所需时间较原代高密度培养细胞所需时间长。原代低密度培养组上清液中糖胺多糖质量浓度显著低于原代及传1代高密度培养组软骨细胞(P<0.001,P<0.05),且时间越长,质量浓度相差越大。 结论与低密度培养相比,平面高密度培养可提高软骨细胞合成糖胺多糖的能力,明显减缓软骨细胞的失分化速度,提示高密度培养更有利于软骨细胞维持表型,是软骨平面培养的较好方式。 实验三不同强度循环拉伸对原代培养兔软骨细胞糖胺多糖合成的影响 目的研究不同强度的循环动态拉伸(Cyclic tenisle strain,CTS)对原代培养的兔关节软骨细胞糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)合成的影响。 方法1月龄新西兰兔6只,无菌手术切取双膝关节软骨,采用0.4%Pronase酶和0.025%Ⅱ型胶原酶消化分离关节软骨细胞,来源于同一只兔的软骨细胞分为3部分,分别接种3块BioFlex培养板,通过Flexercell 4000系统分别给予正弦波形、0.3Hz、6h/d,强度分别为0%、5%、15%的CTS刺激。于加载后24、36、48、60h观察细胞形态,并分别抽取上清测量GAG浓度。采用重复测量资料的方差分析比较不同强度CTS刺激组上清液GAG浓度的差异。 结果细胞力学加载后可见周边部软骨细胞由多角形变为纺锤形,沿培养皿半径垂直方向排列。随拉伸强度的增加,上清GAG浓度依次上升(P<0.001),且经两两比较有显著性差异(P<0.05)。随时间增加,上清GAG浓度逐渐增加(P<0.001)。时间与加载条件之间存在交互效应,时间越长,加载组与对照组上清GAG浓度相差越大(P<0.001) 结论CTS可促进单层贴壁关节软骨细胞合成GAG,作用效果随拉伸强度增大而增加。 第二部分大鼠膝关节负重与非负重区软骨组织学对比分析 目的观察大鼠膝关节软骨负重区与非负重区组织形态、基质蛋白多糖成分和Ⅱ型胶原分布差异。 方法Wistar大鼠5只,切取双膝关节,固定,脱钙,包埋,沿矢状面整体切片,HE染色,PH值1.0和2.5阿尔新蓝染色,番红0染色,阿尔新蓝-番红0复染观察软骨形态结构和基质蛋白多糖成分,免疫组化检测Ⅱ型胶原分布并测量软骨厚度。分别观察负重区与非负重区软骨形态和基质染色差异,并利用图像分析系统,对基质成分染色深浅进行光密度定量,t检验统计分析。 结果负重区与非负重区软骨厚度、细胞分布、形态结构均有较大差异。负重区软骨较非负重区明显增厚(P<0.05),软骨各层结构特征较非负重区更加明显。非钙化层负重区较非负重区阿尔新蓝浅染,而番红0深染,经图像灰度分析差异均有显著性(P<0.05),钙化层在上述二区染色无明显差异(P>0.05)。复合染色负重区蓝染区域明显少于非负重区(P<0.01)。负重区非负重区软骨非钙化层PH2.5阿尔新蓝染色明显较PH 1.0阿尔新蓝染色加深。免疫组化未发现负重区与非负重区Ⅱ型胶原分布存在差异(P<0.05)。 结论胫骨和股骨髁负重区较非负重区厚度增加,软骨各层结构特征更加明显。非负重区与负重区比较,软骨透明质酸含量明显增加,硫酸软骨素和硫酸角质素含量明显减少,而Ⅱ型胶原含量无差异。说明不同的受力环境造成软骨基质成分差异。同时提示临床用来修复负重区软骨缺损的非负重区软骨缺乏适应负重区力学环境的组织结构。 第三部分运动对大鼠膝关节软骨的影响 实验一大鼠跑步装置的设计与应用 目的研制一种诱导大鼠进行定量匀速跑步运动的实验装置。 方法以外购跑步机提供匀速运动平面,支架将自制罩盒架于跑步机上限制大鼠跑步范围。罩盒前部暗室诱导大鼠进入,中部强光刺激大鼠进入前部暗室,尾部与电击器连接的电极对大鼠进行电刺激驱赶。 结果首次跑步,大鼠仅经过数次电击,即可在跑道内匀速跑步,间断电击可完成训练。3-4天之后,大鼠即可形成条件反射,只需很少的电击即可按设定速度跑步。实验中后期基本不需电击。 结论此设计充分利用大鼠趋暗本能和学习能力,减少了电击刺激的影响,并且具有成本低,易于操控的特点是研究跑步运动对大鼠运动系统影响的有力工具。 实验二长距离平板跑步运动对大鼠膝关节蛋白多糖分布的影响 目的观察长距离平板跑步运动对大鼠关节软骨蛋白多糖分布的影响。 方法Wistar大鼠10只,随机分为对照组和跑步组。对照组笼养,跑步组每天以20m/min速度,连续跑步1000m。连续训练45天后,处死大鼠,切取双膝关节,固定,脱钙,包埋,沿矢状面整体切片,HE染色,番红0染色。观察胫骨内侧平台负重区软骨形态结构和基质染色差异,利用图像分析系统,测量软骨厚度,并对软骨各层染色深浅进行光密度定量。 结果跑步组软骨表面完整,非钙化层厚度较对照组显著下降(P<0.05)。番红O染色,软骨负重区非钙化层平均光密度明显下降(P<0.05),其中表层下降66%(P<0.001),中层下降56%(P<0.001),深层与对照组无显著差异(P>0.05),而钙化层较对照组上升38%(P<0.05)。 结论连续长距离平板运动后,软骨表面完整,但是软骨厚度下降,蛋白多糖含量下降。提示连续长距离平板运动对软骨有一定的损伤作用。 实验三长距离上坡跑步运动对大鼠膝关节软骨基质的损伤作用研究 目的观察长距离上坡跑步运动对大鼠关节软损伤作用。 方法成年雄性Wistar大鼠10只,随机分为对照组和跑步运动组,每组5只,对照组笼养,跑步运动组每天以20m/min速度,连续水平跑步1000m,连续训练15d后,改为20°上坡跑,速度距离同前,上坡训练30d后,处死大鼠,切取双膝关节,固定,脱钙,包埋,沿矢状面整体切片,HE染色,番红0染色观察软骨形态结构和基质染色差异,采用OARSI评分对胫骨平台和股骨髁软骨损伤进行评价。 结果上坡运动组软骨表面印度墨水染色显示表面粗糙,切片显示软骨出现明显的损伤,股骨髁与胫骨平台软骨OARSI评分明显高于对照组(P<0.01)。损伤修复组织Ⅱ型胶原免疫组化阴性。 结论连续长距离上坡运动,可造成软骨应力负荷增加,导致软骨发生明显损伤。 第四部分膝骨关节炎放射学骨赘表现与内翻角相关性分析 目的探讨膝骨关节炎患者放射检查骨赘表现与膝关节内翻角的关系。 方法利用自制X光测量板对膝骨关节炎患者13例,共18膝,行DR照相,测量膝关节内翻角。利用Photoshop软件通过数码影像测量骨赘长度。骨赘长度与胫骨平台宽度的比值,称为突起指数,用以排除个体大小差异和投照放大等因素对骨赘长度测量的影响。应用SPSS软件通过Pearson相关检验探索膝关节骨赘大小和外翻角之间的关系。 结果内翻角与股骨内侧平台骨赘长度有正相关性(r_s=0.585,P=0.014),与胫骨内侧骨赘突起指数有较高的正相关性(r_s=0.761,P<0.001),内翻角与膝关节外侧室骨赘突起指数间尚不能认为有相关性存在。 结论膝骨关节炎患者内侧室骨赘的大小与膝关节内翻程度有关,软骨异常受力后分泌细胞因子变化可能是此现象的原因。提示软骨细胞力学生物学研究对阐明骨关节炎的发病机理很有价值,有待进一步研究。


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