收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

小鼠胚胎E10~E12造血扩增部位的探寻及其分子作用机制的研究

黄丽芳  
【摘要】: 第一部分 [目的]探讨AGM时期(E10~E12)小鼠造血部位的解剖结构。 [方法]将雌、雄小鼠以3: 1合笼喂养,观察小鼠阴道栓获得准确孕期的小鼠胚胎,收集E10, E10.5, E11, E11.5和E12小鼠胚胎,去掉胎膜和胎盘,用4%甲醛固定3h后,进行乙醇脱水,石蜡包埋,通过胚胎正中矢状面组织切片,进行HE染色,在显微镜下连续观察造血部位的组织结构。 [结果]胚胎正中矢状面切片,自E10到E12,在腹部背侧并没有见到典型的性腺,即中肾和主动脉构成的空腔管状结构,却发现在E10时心脏已经发育,表现为圆球形,内部由心肌细胞及表面的内皮细胞构成网状的空间结构,可以看到E10小鼠胚胎已经建立循环,血管管腔和心脏内部可见少量胞体较大、胞浆丰富的造血干细胞。E11的心脏组织切片形态较E10.5并无明显变化,但此时期心腔内的造血细胞数量明显增多,容易见到造血细胞与心脏内皮细胞接触。随着胚胎的发育,心脏的形态很快变化,内部网状结构逐渐减少,在E12已具备成体心脏的特点,成为空腔性结构。小鼠E10胚胎中胎肝已经发育,起初为实质的结构,由胎肝细胞紧密联系而构成,内部管腔少,随着胚胎的发育,胎肝内部血管增多。 [结论]通过E10~E12胚胎正中矢状面连续切片和HE染色,并未发现典型的AGM区结构,可能与组织切片的局限性有关;心脏起初内部呈复杂的空间网状结构,且心肌细胞表面覆盖有一层内皮细胞,在造血干细胞发育过程中构成了巨大的表面积。 第二部分 [目的]研究E10~E12期间小鼠胚胎心脏内皮细胞特性及与造血的发育相关的分子机制。 [方法]将E10~E12小鼠胚胎的组织切片做免疫组化,检测胚胎心脏是否表达血管特异性标志CD34蛋白;利用已制备好的石蜡切片,通过免疫组化检测各时间点胚胎心脏和胎肝中Notch信号通路相关分子,Notch 1和Jagged1蛋白的表达水平;并且用免疫磁珠分选出c-kit阳性细胞,通过免疫荧光的方法检测其细胞表面Notch 1蛋白的表达情况。分别取出E10, E10.5, E11, E11.5和E12的胚胎心脏、胎肝和AGM区组织,经机械碾磨、胶原酶消化和过滤制备单个细胞悬液,采用差异贴壁法及贴壁培养获得基质细胞,观察各组织贴壁细胞形态,检测CD31表达情况。 [结果] E10~E12的小鼠胚胎心脏的心肌细胞及其表面的内皮细胞均表达血管特异性标志CD34蛋白,以E11表达强度最高,同时可以见到循环的造血细胞也大多表达CD34抗原。对组织切片进行了Notch信号通路免疫组化的研究,发现E10心脏心肌细胞及其表面的内皮细胞形成的中空的网状结构都表达Jagged1蛋白和Notch 1蛋白,前者表达水平高于后者,以E10.5时水平最高,且随着心脏的发育和形态改变,表达水平逐渐下降,到E12时几乎消失。同时发现血管内皮细胞也表达Jagged1,但是不表达Notch1蛋白。用c-kit单抗的免疫磁珠分选出c-kit阳性细胞,通过免疫荧光,显示这群细胞表面均匀的表达Notch 1蛋白。原代心脏贴壁细胞由体积较大、胞浆丰富、呈不规则形的心肌细胞和细长梭形、胞浆较少的内皮细胞构成,容易看到心脏内皮细胞贴附在心肌细胞表面,呈均一的细长梭形排列,表达CD31抗原。胎肝贴壁细胞形态相对均一,均为胞体较大、胞浆丰富的细胞。同期AGM区贴壁细胞在原代细胞中也可见两个细胞群体,包括胞体较大的贴壁细胞和细长梭形的内皮细胞,形态与心脏贴壁细胞相似。 [结论]胚胎E10~E12期间心脏的心肌细胞及其内皮细胞均表达CD34抗原,具备血管内皮细胞特性,网状结构构成巨大的表面积,并且高表达Jagged1和Notch 1蛋白,形成胚胎造血良好的微环境,可能参与此时期造血干细胞的发育和扩增。 第三部分 [目的]E10~E12时期造血的相关部位Notch信号通路的变化水平及对胚胎中期HSCs扩增部位的初探。 [方法]通过实时定量PCR连续观察E10, E10.5, E11, E11.5和E12心脏内皮细胞和胎肝基质细胞Notch 1及Jagged1表达及变化水平。用流式单标检测各时间点心脏和胎肝中c-kit+细胞比率。将培养24h后的E11心脏悬浮细胞分别置入由同期的心脏内皮细胞、胎肝基质细胞和AGM区基质细胞构成的共培养体系中,于0h, 24h和48h分别检测c-kit+细胞比率,研究各组织基质细胞对HSCs扩增的影响。 [结果]尽管传代对心脏贴壁细胞形态有影响,但是传代和原代细胞中Jagged1和Notch 1基因的表达水平没有变化。我们发现:心脏贴壁细胞的Jagged1基因在E10.5到最高,跟E10的基因水平相比较,为E10的(5.46±2.2)倍,E11时的表达下降,几乎与E10相同,但是E11.5和E12时心脏内皮细胞Jagged1表达均很低,分别为E10的(0.15±0.44)倍和(0.12±0.50)倍。但是胎肝基质细胞Jagged1基因除E11的表达与E10的心脏内皮细胞相近外,其余胚胎时期均呈低水平表达。通过流式检测c-kit+细胞我们发现,胚胎期心脏和胎肝c-kit+细胞比率几乎一致,E11时c-kit+细胞明显增多,分别高达(12.6±3.2)%和(9.6±2.8)%,但E12时心脏中c-kit+细胞明显减少,仅为(3.4±1.2)%,此时胎肝中c-kit+细胞为(11.6±4.1)%。E11的悬浮细胞与心脏内皮细胞和AGM区基质共培养24h时,c-kit+细胞数量保持稳定,但在胎肝基质细胞中c-kit+细胞数量明显减少,在共培养48h,三组中的c-kit+细胞均呈较低水平,组间没有显著性差异。 [结论]心脏内皮细胞中Jagged1基因表达是变化的,在E10.5时表达最高,伴随着c-kit+细胞数量的扩增。Notch信号通路在胎肝中HSCs的发育并不起主要作用。通过c-kit+细胞分别与各种同时期基质细胞共培养,推测E11胚胎心脏和AGM区具备HSCs扩增的环境,E11的胎肝可能并不是造血扩增的重要部位。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 刘恩岐,杨鹏辉,仓林让,尚荣军;小鼠胚胎吸管的改进[J];西安交通大学学报(医学版);2002年06期
2 张璇,王红梅,林海燕,李庆雷,刘冬林,钱东,刘国艺,祝诚;一氧化氮对小鼠胚胎植入的调控[J];科学通报;2002年13期
3 曾卫,封志纯;人无血清输卵管上皮细胞模型与小鼠胚胎共培养的研究[J];中华妇产科杂志;1998年10期
4 熊习昆,蔡玟,谢晓萍,梁雪梅,古梅英,陆凌霞;染发剂对小鼠胚胎毒性效应的观察[J];广东卫生防疫;1998年01期
5 赵四海;郑华东;楚雍烈;林燕;张春芳;陈正兰;朱虹;杨鹏辉;刘恩岐;;两种小鼠胚胎移植方法的比较[J];第四军医大学学报;2007年06期
6 丛笑倩;小鼠胚胎性干细胞及其在发育和遗传研究中的应用[J];细胞生物学杂志;1992年02期
7 刘丽均,顾建忠,朱东琴,符杰,施美莲,张瑞忠,徐平;不同品系小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究[J];中国实验动物学报;2002年02期
8 夏英英,王丽,张炜;白血病因子及其抗体对小鼠胚胎着床影响的体外研究[J];中国医师杂志;2005年09期
9 赵玉林,董明敏,董民声;小鼠胚胎及出生后耳蜗发育的组织学研究[J];中华耳鼻咽喉科杂志;1999年01期
10 陈悦洲;原玮;任永生;;子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响[J];郧阳医学院学报;2006年06期
11 况玲;郭庆勇;武聚富;张慧;袁龙;;小鼠胚胎移植实验方法[J];实验动物科学;2008年01期
12 ;科技快讯[J];中国基础科学;2012年03期
13 刘建新,罗丽兰,阎洁,艾继辉;体外无血清小鼠胚胎种植模型的建立[J];中华妇产科杂志;2000年07期
14 吴燕,马子敏,刘淑红,范文红,范明;小鼠胚胎整体原位杂交实用技术的建立[J];解剖学报;2004年04期
15 刘淑琴;秦建民;曾锦章;郭婷婷;郭琳娜;吴孟超;王红阳;;不同时期小鼠胚胎整体石蜡标本的制备技术[J];解剖学杂志;2005年06期
16 何志英,王敏毅,王寒正,张兆耕,马贤凯;重组白细胞介素-1β对小鼠胚胎着床的影响[J];生殖与避孕;1994年02期
17 王永红,颜永杉,苗毓华,张婷,赫荣乔;乙醛磺酸对小鼠胚胎细胞遗传和胚胎发育影响的研究[J];遗传学报;1997年04期
18 余增丽,李云,段广才;用小鼠胚胎肢体器官培养研究锌对骨发育的影响[J];卫生研究;2002年03期
19 杨艳萍 ,景雅;原始心肌的存在对小鼠胚胎心脏流出道心内膜特征的维持作用[J];山西医药杂志;2004年04期
20 丰培勋;轩东英;金岩;顾晓明;雷战军;;MCPR1在小鼠胚胎发育中的表达[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2005年12期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李均;汪维伟;;小鼠胚胎消化管上皮细胞凋亡相关基因表达的初步观察[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
2 刘国艺;倪江;;上皮-钙粘素在小鼠胚胎植入中的作用[A];中国生理学会、中国神经科学会2005年神经内分泌免疫学术研讨会论文摘要汇编[C];2005年
3 雷蕾;夏国良;陈秀芬;傅茂勇;王路鹏;;小鼠胚胎卵巢连接蛋白表达情况的初步研究[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
4 刘国艺;倪江;;上皮-钙粘素在小鼠胚胎植入中的作用[A];中国生理学会、中国神经科学会2005年神经内分泌免疫学术研讨会论文摘要汇编[C];2005年
5 李专;兰雨;贺文艳;王俊;罗凌飞;杨晓;刘兵;;小鼠胚胎头部:一个新的造血干细胞发育位点[A];2012全国发育生物学大会摘要集[C];2012年
6 吴燕;范文红;刘淑红;马子敏;范明;;小鼠胚胎整体原位杂交技术的引进与优化[A];中国生理学会第六届应用生理学委员会全国学术会议论文摘要汇编[C];2003年
7 刘为敏;曹宇静;沈政;周家喜;李晶;段恩奎;;整合连接激酶在小鼠胚胎植入中的作用[A];第九次全国生殖生物学学术研讨会论文摘要集[C];2003年
8 倪华;;小鼠胚胎着床的分子调控[A];中国生理学会张锡钧基金会第八届全国青年优秀生理学学术论文综合摘要[C];2003年
9 徐平;;实验大鼠、小鼠胚胎的缓慢冷冻和玻璃化冷冻的比较研究[A];中国实验动物学会青年科技协会第二届学术研讨会论文汇编[C];2001年
10 余增丽;李云;段广才;;用小鼠胚胎肢体器官培养研究锌对骨发育的影响[A];达能营养中心青年科学工作者论坛优秀论文集2002年第3期[C];2002年
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 贺文艳;IL-3对小鼠胚胎血液血管干细胞发育和分化的调控[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
2 井然;Cypher和ENH在小鼠早期心脏发育中的作用及其分子机制[D];中南大学;2012年
3 聂丽;ATP敏感性钾通道在小鼠胚胎心脏发育过程的发育依赖性变化及功能[D];华中科技大学;2012年
4 黄丽芳;小鼠胚胎E10~E12造血扩增部位的探寻及其分子作用机制的研究[D];华中科技大学;2009年
5 钮炜西;小鼠胚胎脐血管的造血功能研究[D];第三军医大学;2012年
6 李舟;JNKs分子在小鼠着床前胚胎中表达、激活及其与细胞凋亡的关系[D];华中科技大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李韧;小鼠胚胎循环血的造血潜能分析[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
2 檀利长;一氧化氮对小鼠胚胎体外发育的影响[D];安徽农业大学;2008年
3 王昕;人和小鼠胚胎肺发育关键基因表达模式的比较研究[D];福建师范大学;2009年
4 钱怀剑;小鼠胚胎体外发育培养基中氨基酸含量变化的研究[D];安徽大学;2010年
5 周帆;小鼠胚胎定向造血发育的表面标志研究[D];安徽医科大学;2013年
6 张万超;致畸量视黄酸对小鼠胚胎Foxc2基因表达的影响[D];吉林大学;2009年
7 徐贺楠;MicroRNA-770在小鼠胚胎发育阶段的表达分析[D];哈尔滨工业大学;2010年
8 王芳;STAT3在小鼠胚胎和出生后早期发育中的表达和活化[D];兰州大学;2011年
9 徐亮;RBBP6敲除小鼠胚胎致死原因的探讨[D];安徽医科大学;2012年
10 杨兴东;小鼠胚胎冷冻保存的研究[D];四川农业大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 通讯员 张国清 记者 王丹;小鼠胚胎头部也是造血干细胞发育位点[N];健康报;2012年
2 冯卫东;人类皮肤形成的关键环节之谜揭晓[N];科技日报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978