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PD-1/PD-L1通路在HBV感染中作用的研究

叶翩  
【摘要】: 第一部分HBV感染者外周血CD8~+T淋巴细胞表面PD-1表达水平与疾病状态的关系 目的:程序性死亡受体-1(PD-1)是一个主要介导细胞间负性信号通路的,大部分表达于活化T细胞表面的跨膜单体蛋白。本研究探讨健康对照,慢性乙型肝炎和重型乙型肝炎患者外周血CD8~+T淋巴细胞表面PD-1的表达水平和HBV特异性CD8~+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)数量,分析PD-1通路与不同HBV感染疾病状态的关系。 方法:流式细胞技术检测健康对照,慢性乙型肝炎和重型乙型肝炎患者外周血CD8~+T淋巴细胞表面PD-1的表达水平;HLA2-抗原肽五聚体结合流式细胞技术检测健康对照,慢性乙型肝炎和重型乙型肝炎患者外周血HBV特异性CD8~+CTLs数量,Real-time PCR法检测患者血清中的HBV DNA含量。 结果:慢性乙型肝炎患者外周血CD8~+T淋巴细胞表面PD-1的阳性表达率(13.86%±3.38%)明显高于健康对照(4.63%±0.73%,P<0.01)和重型乙型肝炎患者(6.80%±2.19%,P<0.01);与重型乙型肝炎患者相比(0.81%±1.23%),慢性乙型肝炎患者外周血HBV特异性CD8~+CTLs占CD8~+T淋巴细胞百分率较少(0.37%±0.43%,P<0.05)。患者外周血CD8~+T淋巴细胞表面PD-1的表达水平与HBV特异性CD8~+CTLs数量成负相关而与血清HBV DNA载量呈明显正相关(P<0.05),与ALT水平则无明显相关性(P>0.05)。 结论:HBV感染患者外周血CD8~+T淋巴细胞表面PD-1的表达水平与患者HBV特异性CTLs数量成负相关,与血清HBV-DNA载量成正相关,与ALT水平则无明显相关性。重型乙型肝炎患者外周血HBV特异性CD8~+CTLs反应比慢性乙型肝炎患者强烈。 第二部分具有免疫活性的慢性HBV感染小鼠模型的建立 目的:建立具有免疫活性的慢性HBV感染小鼠模型 方法:以水动力转染技术将溶于小鼠体重8%PBS的具有复制能力的10μg HBV质粒pAAV/HBV1.2通过尾静脉5秒内高压注射入C57BL/6小鼠体内。注射后第1、30、90天用Real-time PCR法检测小鼠血清中的HBV-DNA水平,注射后第1、14天用ELISA法检测小鼠血清中HBsAg和HBeAg,28天检测抗-HBs和抗-HBc。第105天用免疫组织化学法检测肝组织中的HBsAg,HE染色法检测肝组织的病理学特征,Real-time PCR法检测肝和肾组织中的HBV DNA含量。 结果:60只小鼠注射pAAV/HBV1.2后,有22只小鼠在注射后第1和第14天血清中可检测到HBsAg和HBeAg,其余小鼠血清中始终未检测到HBsAg和HBeAg。小鼠血清中HBV DNA在注射后第1天平均为5.02×10~3copies/mL,然后第30天血清HBV DNA和HBeAg在HBsAg阴性小鼠体内检测不到,但在HBsAg阳性小鼠体内血清病毒平均水平为4.48×10~4 copies/mL,第90天为4.82×10~4copies/mL。尽管模型小鼠产生了抗-HBc,均未发现产生针对HBV的保护性抗体即抗-HBs。第90天检测模型小鼠血清ALT平均水平为130U/L(正常小鼠ALT活力均值范围为16~42U/L)。HE染色发现模型小鼠的肝脏有中等程度的炎症反应。免疫组织化学法发现模型小鼠肝细胞浆中HBsAg为阳性。Real-time PCR法检测到模型小鼠肝和肾组织中有HBV DNA表达。 结论:模型小鼠血清和肝肾组织的HBsAg、HBeAg及HBV DNA阳性结果,HE染色和血清ALT水平显示模型小鼠的肝脏有中等程度的炎症反应。以上结果均表明慢性HBV感染小鼠模型建立成功。 第三部分体内阻断PD-1/PD-L1通路对慢性HBV感染小鼠体内病毒及生化水平的影响 目的:探讨抗PD-L1单克隆抗体在慢性HBV感染小鼠模型体内抗HBV的效果。 方法:建立慢性HBV感染小鼠模型后第90天用Real-timePCR法检测血清中HBVDNA水平。根据HBV DNA水平将18只小鼠配对,分成抗PD-L1单克隆抗体、IgG2a同型对照抗体对照组和PBS对照组(每组6只)。于造模后第91天进行PD-1/PD-L1体内阻断实验:抗PD-L1单克隆抗体阻断组给予含200μg抗PD-L1单克隆抗体的200μlPBS(IgG2a同型对照抗体对照组给予含200μg IgG2a同型对照抗体的200μl PBS,PBS组给予200μl PBS)腹腔注射,隔日一次,一共2次。于注射前1天、注射后第7、14天,Real-time PCR法检测小鼠血清中HBV DNA水平,全自动生化分析仪检测小鼠血清中ALT水平。阻断后第14天Real-time PCR法检测小鼠肝和肾组织中的HBV DNA含量。HE染色分析肝组织病理变化,免疫组织化学法检测肝组织HBsAg表达情况,并分析模型小鼠和健康对照小鼠肝脏内PD-L1的表达。 结果:我们发现模型小鼠肝细胞表达PD-L1的水平显著高于健康对照小鼠(P<0.05)。与腹腔注射含IgG2a同型对照抗体的PBS组和单纯PBS组相比,抗PD-L1单克隆抗体组的肝组织病理学显示肝炎炎症活动度升高,同型对照抗体+PBS组和单纯PBS组肝组织病理学没有明显改变。抗PD-L1单克隆抗体组ALT平均水平由阻断前1天的130U/L升高到阻断后第7天的580U/L,阻断后第14天为558U/L。接受抗PD-L1单克隆抗体注射的小鼠血清HBV DNA载量较同型对照抗体或单独PBS注射小鼠显著降低(P<0.05),并且阻断后其病毒载量仍然持续降低。抗PD-L1单克隆抗体也能抑制小鼠肝和肾组织中HBsAg和HBV-DNA的表达(P<0.05)。各组小鼠保持健康,并未显示出其它任何疾病的表现。 结论:慢性HBV感染小鼠模型肝内表达PD-L1水平较健康对照小鼠显著升高,体内阻断PD-1/PD-L1通路能有效提高小鼠自身抗病毒功能,从而明显降低小鼠血清,肝和肾组织的HBV DNA复制及HBsAg的表达。


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