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纳米羟基磷灰石介导靶向端粒酶逆转录酶RNA干扰的肺癌基因治疗的实验研究

郑庆丰  
【摘要】: 实验一端粒酶逆转录酶siRNA表达质粒的构建、转化、抽提及鉴定 目的:制备可供基因转染的端粒酶逆转录酶siRNA表达质粒。 方法:设计靶向hTERT基因干扰序列GCATTCCTGCTCAAGCTGA,合成两条互补的单链DNA,排列次序如下:BamHⅠ酶切位点、正义序列、loop环、反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子,SalⅠ酶切位点以及HindⅢ酶切位点。合成的寡核苷酸退火;采用BamHⅠ以及HindⅢ双酶切pGenesil-1表达载体,切胶回收线性化载体;退火产物与线性化pGenesil-1质粒表达载体相连接;构建hTERT-siRNA重组质粒。采用CaCl_2法制备感受态菌,将重组质粒转化感受态菌,抽提的重组质粒进行Sa1Ⅰ以及PstⅠ单酶切并行凝胶电泳分析,通过测序鉴定以确定插入的干扰片段的准确性,确认针对hTERT基因的siRNA表达质粒构建成功。用碱裂解法大量抽提,检测质粒的纯度和浓度。 结果:BamHⅠ以及HindⅢ双酶切pGenesil-1表达载体,电泳可见约4800bp的线性化的质粒条带。重组质粒可被Sa1Ⅰ酶切出一条约400bp的DNA条带,无法被PstⅠ酶切;阴性对照质粒无法被Sa1Ⅰ酶切,能够被PstⅠ酶切出一条约400bp的DNA条带。测序表明目的序列准确地插到预计的位点。五次质粒大量抽提pGenesil-hTERT的A260/A280均在1.8~2.0间,浓度为1.30μg/μl~1.77μg/μl。 结论:设计合成的RNA干扰序列准确地克隆到pGenesil-1表达质粒中,靶向hTERT基因的siRNA表达质粒构建成功。该载体可为深入研究端粒酶在肿瘤细胞中的作用机制提供新的手段。大量抽提的pGenesil-hTERT纯度和浓度均能满足基因转染的要求。 实验二纳米羟基磷灰石表面修饰及与DNA的结合 目的:应用多聚赖氨酸表面修饰纳米羟基磷灰石,研究纳米羟基磷灰石表面修饰及与DNA结合的可行性。 方法:采用超声辅助均相沉淀法制备纳米羟基磷灰石。透射电镜观察纳米粒结构。分别在不同pH环境下进行纳米羟基磷灰石(nHAP)的多聚赖氨酸(PLL)修饰。检测nHAP及nHAP-PLL的Zeta电位。采用离心后测上清液DNA浓度及核酸酶消化实验考察PLL修饰后的nHAP结合、保护DNA的能力。 结果:透射电镜下nHAP粒径比较均匀,约(15~20)nm×(60~80)nm左右,分散程度良好。nHAP经Na_2CO_3预处理后在pH 7.4及pH 7.6下可获得较理想的的PLL修饰效果。nHAP的Zeta电位为(—42.4±7.5)mV,nHAP-PLL的Zeta电位为(8.5±1.5)mV,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。DNA结合及抗核酸酶保护实验显示nHAP-PLL和DNA质量比达20∶1时,nHAP-PLL可有效结合并保护相应DNA。 结论:超声辅助均相沉淀法制备的羟基磷灰石为纳米级颗粒,粒径较小且均匀、分散程度良好。纳米羟基磷灰石经Na_2CO3预处理后可以有效地进行多聚赖氨酸修饰。经多聚赖氨酸表面修饰的纳米羟基磷灰石可以有效结合并保护DNA。 实验三纳米羟基磷灰石介导人肺癌A549细胞体外基因转染 目的:探讨经多聚赖氨酸修饰的纳米羟基磷灰石介导人肺癌A549细胞基因转染的可行性。 方法:根据实验二的方法配制nHAP-PLL-DNA复合物。实验分为nHAP-PLL组、脂质体组及对照组,分别配制转染复合物并转染A549细胞。荧光显微镜观察EGFP的表达;流式细胞仪检测pGenesil-1的转染率。 结果:nHAP-PLL组和脂质体组均见EGFP表达阳性的A549细胞,对照组未见EGFP表达阳性的A549细胞;nHAP-PLL组pGenesil-1转染A549细胞的转染率为(31.8±1.9)%,与脂质体组的转染率(33.4±3.7)%差异无统计学意义(P>0.01),对照组未见转染阳性的A549细胞。 结论:纳米羟基磷灰石经多聚赖氨酸表面修饰后可介导人肺癌A549细胞体外基因转染,有望成为一种新型的基因转染载体。 实验四纳米羟基磷灰石介导靶向端粒酶逆转录酶RNA干扰对人肺癌A549细胞的影响 目的:探讨纳米羟基磷灰石介导靶向端粒酶逆转录酶RNA干扰对人肺癌A549细胞的影响 方法:根据实验二的方法配制nHAP-PLL-DNA复合物。实验分为nHAP-PLL组、脂质体组、nHAP组及对照组,分别配制转染复合物并转染A549细胞。四唑盐(MTT)法测定细胞生长活力;应用RT-PCR及Western Blot检测各实验组A549细胞hTERTmRNA及蛋白表达,TRAP-ELISA检测端粒酶活性;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:nHAP-PLL组、脂质体组与nHAP组A549细胞的增殖受到抑制。nHAP-PLL组、脂质体组与nHAP组细胞增殖较对照组差别有统计学意义(P<0.05);nHAP-PLL组抑制细胞增殖较脂质体组及nHAP组明显,差别均有统计学意义(P<0.05)。各组的hTERT mRNA、蛋白表达及端粒酶活性的变化趋势与A549细胞的增殖情况检测结果一致。流式细胞仪检测nHAP-PLL组、脂质体组、nHAP组及对照组细胞凋亡率分别是(28.1±1.4)%,(19.2±1.3)%,(10.9±1.2)%与(0.3±0.2)%。nHAP-PLL组、脂质体组及nHAP组均能诱导A549不同程度细胞凋亡,凋亡率与对照组差别有统计学意义(P<0.05);nHAP-PLL组细胞凋亡较脂质体组及nHAP组明显,差别均有统计学意义(P<0.05)。 结论:纳米羟基磷灰石可诱导人肺癌A549细胞凋亡。人肺癌A549细胞端粒酶逆转录酶高表达,端粒酶逆转录酶可成为抑制A549的理想靶点。纳米羟基磷灰石本身具有抑制A549细胞的作用,又能有效地保护DNA并介导A549细胞靶向端粒酶逆转录酶的RNA干扰,使之在肺癌基因治疗领域具有重要的应用价值。


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