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经典Wnt/β-catenin信号通路在椎间盘退变中的作用及机制研究

王晶  
【摘要】: 一β-catenin在人退变椎间盘髓核组织中的表达及意义 目的检测β连环蛋白(β-catenin)在人退变椎间盘髓核和正常髓核组织中表达差异,初步探讨经典Wnt/β-catenin信号通路与椎间盘退变的关系。 方法收集2007年5月至2008年3月于我院手术的腰椎间盘突出症患者髓核组织标本28例(男17例,女11例)作为试验组,平均年龄45岁(26~63岁);收集同期因腰段脊柱创伤手术治疗的患者髓核组织标本12例(男9例,女3例)作为对照组,平均年龄35岁(18~55岁)。采用实时荧光定量RT-PCR法和蛋白印迹法(western-blot)分别检测退变组和创伤组椎间盘髓核组织β-catenin mRNA与蛋白的表达,比较其差异并进行统计学分析。 结果β-catenin mRNA与蛋白表达在退变组中均明显高于创伤组,荧光定量RT-PCR比值约为2.85:1;蛋白印迹各组平均光密度比值分别为0.76±0.04,0.13±0.02,差异有显著统计学意义(P<0.05)。 结论β-catenin在人退变椎间盘髓核组织中表达增高,提示Wnt/β-catenin信号通路可能在椎间盘退变过程中发挥了作用。 二TNF-α注射构建兔椎间盘退变动物模型中β-catenin蛋白的表达及意义 目的通过外源性TNF-α注射构建兔椎间盘退变动物模型,探讨该模型中β-catenin蛋白的表达及意义,以明确炎性细胞因子在促进腰椎间盘退变过程中Wnt/β-catenin信号通路的作用。 方法选取12只健康成年日本白兔,雌雄随机,体重2.5~3.0Kg。手术暴露L2~53个间隙共36个椎间盘。随机分为4组,分别注入生理盐水,TNF-α5ng,TNF-α10ng,TNF-α20ng,于术后第8周统一处死,取椎间盘髓核组织作HE-番红0染色病理切片进行形态学观察:各组分别随机选取4个椎间盘髓核组织标本,采用蛋白印迹法(western-blot)测定β-catenin蛋白含量并比较各组间差异。 结果HE-番红0染色病理切片显示,在5ng、10ng、20ng组椎间盘组织中髓核细胞数量减少,正常网状结构破坏,细胞形态发生改变,出现肥大空泡样软骨细胞,组织基质蛋白聚糖含量明显降低,番红0淡染,表明兔椎间盘退变动物模型构建成功,退变程度与TNF-α浓度相关。生理盐水对照组椎间盘形态基本正常,无退变发生。蛋白印迹结果显示β-catenin蛋白含量在注射TNF-α组明显增加,各组光密度比值分别为:0.142±0.036、0.351±0.041、0.472±0.052和0.710±0.063,组间差异有显著统计学意义(P<0.05)且与TNF-α浓度相关。 结论通过外源性TNF-α盘内注射能够成功构建兔椎间盘退变动物模型,且退变程度与TNF-α呈浓度依赖性;在退变模型髓核组织中β-catenin蛋白含量增高且与TNF-α浓度相关,提示炎症细胞因子触发了Wnt/β-catenin信号通路,在椎间盘退变过程中可能发挥了重要作用。 三绿色荧光蛋白标记的重组DKK-1腺病毒表达载体的构建 目的构建绿色荧光蛋白(green fluorescent prorein,GFP)标记的DKK1腺病毒表达载体,对表达产物进行鉴定,分离、纯化并大量扩增 方法构建含配对序列、酶切位点和DKK-1基因序列的PCR引物,使用PCR技术从DKK1质粒中提取DKK1基因序列,与pDC315-eGFP真核表达载体分别进行双酶切并纯化酶切产物,在感受态大肠杆菌细胞反应体系中构建真核表达载体,提取阳性克隆进行PCR产物鉴定,同AdMax腺病毒包装系统共转染HEK293细胞重组并包装出腺病毒载体,培养HEK293细胞进行病毒扩增,按Adeno-X~(TM) Virus Purification Kit(BD Biosciences,Clontech)步骤纯化重组腺病毒。使用腺病毒转染正常HEK293细胞,24小时后观察GFP荧光表达情况。 结果PCR证实重组腺病毒包含DKK-1基因,转染HEK293细胞后荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光稳定表达,蛋白检测发现可表达GFP。 结论成功构建绿色荧光蛋白标记的重组DKK-1腺病毒表达载体,能感染HEK293细胞并表达目的基因,通过GFP标记可连续而直接地观察细胞中的基因表达。 四DKK1腺病毒阻断Wnt信号通路对体外培养兔髓核细胞基质的保护作用 目的探讨Wnt通路在髓核细胞退变中的生物学机制及DKK1腺病毒阻断Wnt信号通路对体外培养兔髓核细胞基质的保护作用。 方法体外培养免椎间盘髓核细胞,取培养第二代细胞随机分为4组加药,A组:空白对照组,正常培养基培养;B组:加入TNF-α20ng/ml作为退变组;C组:加入MOI为200的Adv-eGFP腺病毒液,TNF-α20ng/ml作为荧光对照组:D组:加入MOI为200的Adv-hDKK1腺病毒液,TNF-α20ng/ml作为实验组。转染换液后继续培养一周,PT-PCR法检测不同组β-catenin、Ⅱ型胶原和MMP-13 mRNA的表达;免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原表达;番红0染色检测蛋白聚糖的表达变化,荧光显微镜镜下观察各组eGFP表达情况。 结果倒置相差显微镜发现B组和C组髓核细胞数量减少,正常网状结构破坏,细胞形态不规则,排列紊乱;A组和D细胞形态基本正常,部分细胞互相粘附。PT-POR法检测不同组β-catenin、Ⅱ型胶原和MMP-13 mRNA发现:β-catenin mRNA在A组基本不表达,B组和C组明显表达,D组仅少许表达,与内参比值分别为B组0.677,C组0.632,D组0.121;Ⅱ型胶原mRNA在A组和D组表达明显高于B组和C组,与内参比值分别为A组0.652,B组0.159,C组0.214,D组0.638;MMP-13 mRNA在B组和C组表达明显高于A组和D组,与内参光密度比值分别为A组0.184,B组0.627,C组0.632,D组0.154。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示A和D组呈现阳性,B组和C组为弱阳性,仅有少数细胞染色,Ⅱ型胶原蛋白表达明显降低,番红染色显示蛋白聚糖含量在C和B组较A和D组明显降低,胞外基本无红染,仅少数细胞周围淡染。荧光显微镜观察显示C和D组明显荧光表达,A组和B组为阴性,表明Adv-hDKK-1腺病毒成功转染髓核细胞且表达目的基因。 结论退变组和荧光对照组细胞发生退行性改变,β-catenin和MMP mRNA表达明显增高,Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达明显降低,蛋白聚糖含量明显降低。实验组细胞形态正常,β-catenin和MMP-13 mRNA仅少许表达,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达正常。这表明200MOI的Adv-hDKK1能成功转染髓核细胞且表达目的基因,DKK1在TNF诱导的髓核细胞退变过程中阻断了Wnt/β-catenin信号通路的作用,保护基质的正常代谢。


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