循环平滑肌祖细胞在低氧性肺无肌细动脉肌化中的作用

【摘要】： 长期慢性低氧是引起肺动脉重塑(Pulmonary artery remodeling，PAR)进而导致肺动脉高压(Pulmonary hypertension，PH)的重要因素。肺无肌细动脉肌化是低氧引起的PAR的重要特征之一。既往认为，引起肺无肌细动脉肌化的机制主要是由于临近动脉的血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMC)迁移及增殖而来，但临床针对VSMC的迁移和增殖治疗效果不明显，提示尚存在其他的机制。Myocardin是血清反应因子(Serum response factor，SRF)的一种共辅助因子，参与平滑肌细胞(Smooth muscle cells，SMCs)及心肌细胞的分化，是SMCs和心肌细胞分化所必须的。用myocardin过表达载体转染纤维母细胞和干细胞均可使其表达SMCs的分子标志，且移植到心急梗死灶中的骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stemceils，MSCs)强制表达myocardin后心功能得到明显改善，结果证实移植的MSCs在myocardin的调控下有效分化为心肌细胞。已经证实循环血液存在平滑肌祖细胞(Smooth muscle progenitor cells，SPCs)。在低氧条件下SPCs可以归巢到动脉粥样硬化斑块及缺血的肢体等病灶中并发挥生物学作用。慢性低氧不仅动员骨髓干细胞而且可诱导循环c-kit~+祖细胞参与肺动脉外膜重塑及肺动脉滋养血管的形成。鉴于以上研究基础，我们设想：在慢性低氧条件下，循环SPCs归巢至肺无肌细动脉，在myocardin的调控下分化为VSMCs从而参与了低氧性肺无肌细动脉的肌化。本研究分三个部分。 第一部分：大鼠循环平滑肌祖细胞的分离、鉴定及分化 目的：分离大鼠循环血液中的平滑肌祖细胞(SPCs)并鉴定其表型，为后续研究打下基础。方法：采用单核细胞集落刺激因子(M-CSF)注射法动员大鼠骨髓干细胞，第六天收集循环血液经密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs)，用磁激活的细胞分选法(MACS)分离具有CXCR4~+／PDGFRβ~+表型的祖细胞。采用富含PDGF-BB的培养液常规条件下诱导祖细胞分化，用细胞免疫荧光，RT-PCR，Western blot检测分化细胞的SMCs表型标记物，透射电镜检测分化细胞的超微结构从而判断分离的祖细胞的SMCs分化潜能；低氧(1％O_2)条件下培养上述祖细胞，观察祖细胞的SMCs分化情况，用细胞免疫荧光，RT-PCR，Western blot检测分化细胞的SMCs表型标记物，透射电镜检测分化细胞的超微结构从而判断低氧诱导的分化细胞是否为典型的SMCs。结果：从G-CSF动员的大鼠外周血液MNCs中成功分离出具有CXCR4~+／PDGFRβ~+表型的祖细胞，FCM证实纯度达93．7％，细胞免疫荧光证实祖细胞表达CXCR4及PDGFRβ。经富含PDGF-BB的无血清培养液诱导后，CXCR4~+／PDGFRβ~+祖细胞发生了典型的形态学变化，从小、圆形细胞转变为多角形、梭型细胞，细胞长满后具有SMCs的“峰谷”特征；免疫荧光、RT-PCR及western blot检测到分化细胞表达α-SMA，SM22α，calponin及SM-MHC，透射电镜证实分化细胞具有肌丝、密体，密斑等SMCs超微结构；低氧条件下，CXCR4~+／PDGFRβ~+祖细胞具有和PDGF-BB诱导下相似的形态学变化；免疫荧光、RT-PCR及Western blot检测到分化细胞表达α-SMA，SM22α，calponin及SM-MHC，透射电镜亦证实分化细胞具有肌丝、密体，密斑等SMCs超微结构。结论：大鼠循环CXCR4+~／PDGFRβ~+祖细胞为平滑肌祖细胞，体外低氧可诱导其分化为成熟的SMCs。 第二部分：Myocardin在CXCR4~+／PDGFRβ~+祖细胞体外SMC分化中的表达及作用 目的：检测Myocardin在CXCR4~+／PDGFRβ~+祖细胞分化过程中的表达，探讨干扰myocardin后对CXCR4~+／PDGFRβ~+祖细胞分化为SMCs的影响。方法：以慢病毒质粒pGCSIL-GFP为基础构建针对myocardin mRNA靶点的慢病毒干扰质粒(lentivirus-GFP-shMyocd)及阴性对照质粒(lentivirus-GFP-NC)；用有效靶点的myocardin慢病毒干扰质粒转染CXCR4+~／PDGFRβ~+祖细胞获得稳定表达，将稳定转染干扰病毒的祖细胞置于低氧条件下诱导分化，用RT-PCR及western blot检测不同时间点分化细胞内的myocardin及SMCs分化标志基因的表达。结果：成功构建滴度为1×10~9TU／ml的lentivirus-GFP-shMyocd和5×10~9TU／ml的lentivirus-GFP-NC干扰病毒。RT-PCR及western blot证实刚分离的CXCR4~+／PDGFRβ~+祖细胞不表达myocardin，PDGF-BB和低氧诱导后7天后表达myocardin，14天达到峰值，21天分化细胞成熟时其表达下降。用lentivirus-GFP-shMyocd预转染CXCR4~+／PDGFRβ~+祖细胞后再将细胞置于低氧条件下分化，RT-PCR及western blot结果显示lentivirus-GFP-shMyocd质粒有效减低了低氧所诱导的myocardin表达，敲减后的祖细胞中SMCs分化标记基因表达趋势与myocardin表达下降趋势相一致。结论：体外低氧诱导CXCR4~+／PDGFRβ~+祖细胞中myocardin的表达介导了祖细胞向SMCs分化。 第三部分：Myocardin调控CXCR4~+/PDGFRβ~+ SPCs参与低氧性肺无肌细动脉肌化 目的：探讨慢性低氧是否诱导循环平滑肌祖细胞(SPCs)归巢至肺无肌细动脉以及该归巢的SPCs在低氧诱导的肺无肌细动脉肌化中的作用。方法：GFP转基因C57BL6／J小鼠骨髓细胞移植到经过亚致死量~(60)Co照射的Wt C57BL6／J小鼠以形成骨髓细胞嵌合小鼠，嵌合成功的小鼠低氧(10％O_2)饲养4wk，采用激光共聚焦显微镜观察肺动脉上GFP荧光的分布，western blot分析肺组织内GFP蛋白的表达；用慢病毒干扰质粒转染CXCR4~+／PDGFRβ~+ SPC形成稳定表达细胞，将该稳定转染的SPCs经颈静脉输入Wistar大鼠。经6wk低氧后检测大鼠平均肺动脉压(mPAP)，处死大鼠取出肺组织，免组织化学染色检测肺血管α-SMA表达，结合弹力纤维染色判断肺动脉肌化程度，测定大鼠肌化血管壁的平均厚度；显微切割肌化血管并经定量PCR检测肌化肺动脉中myocardin mRNA的表达；同时冰冻切片经免疫荧光标记VEVSMC的α-SMA，激光共聚焦显微镜下观察α-SMA的表达及定位，结合GFP的表达情况判断输入的SPCs在肌化动脉上的定位及分化情况。结果：骨髓细胞嵌合小鼠经4wk低氧后观察到肺血管中具有较多的GFP信号，western blot亦证实嵌合小鼠低氧下较常氧条件下肺组织内GFP蛋白显著增加。Wistar大鼠经6wk低氧后，mPAP、肺动脉肌化程度及肌化血管平均厚度明较常氧组升高。接受SPCs输注低氧大鼠较未接受SPCs输注大鼠其mPAP、肺动脉肌化程度、肌化血管平均厚度均高于单纯低氧组。显微镜下见SPCs输注低氧大鼠肌化动脉壁见GFP阳性细胞，部分细胞同时α-SMA阳性。接受lentivirus-GFP-shMyocd转染SPCs低氧大鼠其mPAP、肺动脉肌化程度、肌化动脉平均厚度较lentivirus-GFP-NC转染SPCs低氧大鼠明显减低。最后，对显微切割分离的肌化肺动脉组织myocardin mRNA定量分析表明，输注转染lentivirus-GFP-shMyocd的SPCs低氧大鼠肌化肺动脉myocardinmRNA较转染对照质粒祖细胞低氧大鼠及单纯输注祖细胞低氧大鼠均显著下降，并与其mPAP及肌化程度变化相一致。结论：低氧诱导归巢到肺动脉的CXCR4~+/PDGFRβ~+SPCs表达myocardin并调控其分化为VSMCs从而参与低氧性肺无肌细动脉肌化。 结论： 结合前面三部分的结果，我们认为：低氧能诱导循环CXCR4~+／PDGFRβ~+的SPCs归巢至肺无肌细动脉并促进归巢的SPCs表达myocardin；在myocardin的介导下归巢的SPCs进而分化为VSMC。该过程可能在低氧性肺无肌细动脉的肌化过程中起重要作用。