收藏本站
收藏 | 论文排版

循环平滑肌祖细胞在低氧性肺无肌细动脉肌化中的作用

揭伟  
【摘要】: 长期慢性低氧是引起肺动脉重塑(Pulmonary artery remodeling,PAR)进而导致肺动脉高压(Pulmonary hypertension,PH)的重要因素。肺无肌细动脉肌化是低氧引起的PAR的重要特征之一。既往认为,引起肺无肌细动脉肌化的机制主要是由于临近动脉的血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMC)迁移及增殖而来,但临床针对VSMC的迁移和增殖治疗效果不明显,提示尚存在其他的机制。Myocardin是血清反应因子(Serum response factor,SRF)的一种共辅助因子,参与平滑肌细胞(Smooth muscle cells,SMCs)及心肌细胞的分化,是SMCs和心肌细胞分化所必须的。用myocardin过表达载体转染纤维母细胞和干细胞均可使其表达SMCs的分子标志,且移植到心急梗死灶中的骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stemceils,MSCs)强制表达myocardin后心功能得到明显改善,结果证实移植的MSCs在myocardin的调控下有效分化为心肌细胞。已经证实循环血液存在平滑肌祖细胞(Smooth muscle progenitor cells,SPCs)。在低氧条件下SPCs可以归巢到动脉粥样硬化斑块及缺血的肢体等病灶中并发挥生物学作用。慢性低氧不仅动员骨髓干细胞而且可诱导循环c-kit~+祖细胞参与肺动脉外膜重塑及肺动脉滋养血管的形成。鉴于以上研究基础,我们设想:在慢性低氧条件下,循环SPCs归巢至肺无肌细动脉,在myocardin的调控下分化为VSMCs从而参与了低氧性肺无肌细动脉的肌化。本研究分三个部分。 第一部分:大鼠循环平滑肌祖细胞的分离、鉴定及分化 目的:分离大鼠循环血液中的平滑肌祖细胞(SPCs)并鉴定其表型,为后续研究打下基础。方法:采用单核细胞集落刺激因子(M-CSF)注射法动员大鼠骨髓干细胞,第六天收集循环血液经密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs),用磁激活的细胞分选法(MACS)分离具有CXCR4~+/PDGFRβ~+表型的祖细胞。采用富含PDGF-BB的培养液常规条件下诱导祖细胞分化,用细胞免疫荧光,RT-PCR,Western blot检测分化细胞的SMCs表型标记物,透射电镜检测分化细胞的超微结构从而判断分离的祖细胞的SMCs分化潜能;低氧(1%O_2)条件下培养上述祖细胞,观察祖细胞的SMCs分化情况,用细胞免疫荧光,RT-PCR,Western blot检测分化细胞的SMCs表型标记物,透射电镜检测分化细胞的超微结构从而判断低氧诱导的分化细胞是否为典型的SMCs。结果:从G-CSF动员的大鼠外周血液MNCs中成功分离出具有CXCR4~+/PDGFRβ~+表型的祖细胞,FCM证实纯度达93.7%,细胞免疫荧光证实祖细胞表达CXCR4及PDGFRβ。经富含PDGF-BB的无血清培养液诱导后,CXCR4~+/PDGFRβ~+祖细胞发生了典型的形态学变化,从小、圆形细胞转变为多角形、梭型细胞,细胞长满后具有SMCs的“峰谷”特征;免疫荧光、RT-PCR及western blot检测到分化细胞表达α-SMA,SM22α,calponin及SM-MHC,透射电镜证实分化细胞具有肌丝、密体,密斑等SMCs超微结构;低氧条件下,CXCR4~+/PDGFRβ~+祖细胞具有和PDGF-BB诱导下相似的形态学变化;免疫荧光、RT-PCR及Western blot检测到分化细胞表达α-SMA,SM22α,calponin及SM-MHC,透射电镜亦证实分化细胞具有肌丝、密体,密斑等SMCs超微结构。结论:大鼠循环CXCR4+~/PDGFRβ~+祖细胞为平滑肌祖细胞,体外低氧可诱导其分化为成熟的SMCs。 第二部分:Myocardin在CXCR4~+/PDGFRβ~+祖细胞体外SMC分化中的表达及作用 目的:检测Myocardin在CXCR4~+/PDGFRβ~+祖细胞分化过程中的表达,探讨干扰myocardin后对CXCR4~+/PDGFRβ~+祖细胞分化为SMCs的影响。方法:以慢病毒质粒pGCSIL-GFP为基础构建针对myocardin mRNA靶点的慢病毒干扰质粒(lentivirus-GFP-shMyocd)及阴性对照质粒(lentivirus-GFP-NC);用有效靶点的myocardin慢病毒干扰质粒转染CXCR4+~/PDGFRβ~+祖细胞获得稳定表达,将稳定转染干扰病毒的祖细胞置于低氧条件下诱导分化,用RT-PCR及western blot检测不同时间点分化细胞内的myocardin及SMCs分化标志基因的表达。结果:成功构建滴度为1×10~9TU/ml的lentivirus-GFP-shMyocd和5×10~9TU/ml的lentivirus-GFP-NC干扰病毒。RT-PCR及western blot证实刚分离的CXCR4~+/PDGFRβ~+祖细胞不表达myocardin,PDGF-BB和低氧诱导后7天后表达myocardin,14天达到峰值,21天分化细胞成熟时其表达下降。用lentivirus-GFP-shMyocd预转染CXCR4~+/PDGFRβ~+祖细胞后再将细胞置于低氧条件下分化,RT-PCR及western blot结果显示lentivirus-GFP-shMyocd质粒有效减低了低氧所诱导的myocardin表达,敲减后的祖细胞中SMCs分化标记基因表达趋势与myocardin表达下降趋势相一致。结论:体外低氧诱导CXCR4~+/PDGFRβ~+祖细胞中myocardin的表达介导了祖细胞向SMCs分化。 第三部分:Myocardin调控CXCR4~+/PDGFRβ~+ SPCs参与低氧性肺无肌细动脉肌化 目的:探讨慢性低氧是否诱导循环平滑肌祖细胞(SPCs)归巢至肺无肌细动脉以及该归巢的SPCs在低氧诱导的肺无肌细动脉肌化中的作用。方法:GFP转基因C57BL6/J小鼠骨髓细胞移植到经过亚致死量~(60)Co照射的Wt C57BL6/J小鼠以形成骨髓细胞嵌合小鼠,嵌合成功的小鼠低氧(10%O_2)饲养4wk,采用激光共聚焦显微镜观察肺动脉上GFP荧光的分布,western blot分析肺组织内GFP蛋白的表达;用慢病毒干扰质粒转染CXCR4~+/PDGFRβ~+ SPC形成稳定表达细胞,将该稳定转染的SPCs经颈静脉输入Wistar大鼠。经6wk低氧后检测大鼠平均肺动脉压(mPAP),处死大鼠取出肺组织,免组织化学染色检测肺血管α-SMA表达,结合弹力纤维染色判断肺动脉肌化程度,测定大鼠肌化血管壁的平均厚度;显微切割肌化血管并经定量PCR检测肌化肺动脉中myocardin mRNA的表达;同时冰冻切片经免疫荧光标记VEVSMC的α-SMA,激光共聚焦显微镜下观察α-SMA的表达及定位,结合GFP的表达情况判断输入的SPCs在肌化动脉上的定位及分化情况。结果:骨髓细胞嵌合小鼠经4wk低氧后观察到肺血管中具有较多的GFP信号,western blot亦证实嵌合小鼠低氧下较常氧条件下肺组织内GFP蛋白显著增加。Wistar大鼠经6wk低氧后,mPAP、肺动脉肌化程度及肌化血管平均厚度明较常氧组升高。接受SPCs输注低氧大鼠较未接受SPCs输注大鼠其mPAP、肺动脉肌化程度、肌化血管平均厚度均高于单纯低氧组。显微镜下见SPCs输注低氧大鼠肌化动脉壁见GFP阳性细胞,部分细胞同时α-SMA阳性。接受lentivirus-GFP-shMyocd转染SPCs低氧大鼠其mPAP、肺动脉肌化程度、肌化动脉平均厚度较lentivirus-GFP-NC转染SPCs低氧大鼠明显减低。最后,对显微切割分离的肌化肺动脉组织myocardin mRNA定量分析表明,输注转染lentivirus-GFP-shMyocd的SPCs低氧大鼠肌化肺动脉myocardinmRNA较转染对照质粒祖细胞低氧大鼠及单纯输注祖细胞低氧大鼠均显著下降,并与其mPAP及肌化程度变化相一致。结论:低氧诱导归巢到肺动脉的CXCR4~+/PDGFRβ~+SPCs表达myocardin并调控其分化为VSMCs从而参与低氧性肺无肌细动脉肌化。 结论: 结合前面三部分的结果,我们认为:低氧能诱导循环CXCR4~+/PDGFRβ~+的SPCs归巢至肺无肌细动脉并促进归巢的SPCs表达myocardin;在myocardin的介导下归巢的SPCs进而分化为VSMC。该过程可能在低氧性肺无肌细动脉的肌化过程中起重要作用。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 郭强;张凯;刘谟焓;孔庆龙;;1-磷酸鞘氨醇促进大鼠血管平滑肌细胞迁移的实验研究[J];军事医学;2011年04期
2 魏朝辉;陈乃耀;;低氧与白血病细胞分化、凋亡[J];中国煤炭工业医学杂志;2007年02期
3 董小黎,陈瑞芬,刘国贞;慢性低氧过程中肺血管内皮细胞损伤和一氧化氮合酶变化[J];中国病理生理杂志;2002年03期
4 王关嵩;钱桂生;;低氧肺血管重构的分子机制研究概况及展望[J];第三军医大学学报;2009年01期
5 钟天乐,张志刚,何公平;实验性低氧性肺血管改建的a-平滑肌肌动蛋白表达和超微结构观察[J];上海医学;1994年03期
6 周叶萍;舒茂琴;;Geminin在血管平滑肌细胞分化表型转化中的介导作用[J];第三军医大学学报;2010年17期
7 丁亚光,齐建光,杜军保,唐朝枢;通过微量渗透泵应用肾上腺髓质素对大鼠低氧性肺动脉高压的调节作用[J];实用儿科临床杂志;2005年07期
8 张刘锋;;Rho激酶在心血管生理和病理生理中的作用(续一)[J];中华高血压杂志;2009年10期
9 陈彦凡,陈少贤;血管内皮生长因子和低氧性肺动脉高压[J];国外医学.呼吸系统分册;2000年02期
10 刘兆轩;熊吉信;杨春江;刘小春;戴育成;;小鼠胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞的定向分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年12期
11 蒋永亮,戴爱国,李启芳;成肌纤维细胞在大鼠低氧性肺动脉高压发病中的作用[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2005年01期
12 罗颖;李志超;张齐;张博;刘毅;彭利静;宋祖军;;VEGF和PCNA在慢性低氧性肺动脉及高压大鼠主动脉、肺动脉平滑肌细胞中表达[J];细胞与分子免疫学杂志;2006年01期
13 朱阿楠;林丽娜;王万铁;王少军;金可可;金立达;汪洋;王青;;三七总皂甙对低氧高二氧化碳性肺血管收缩的影响[J];温州医学院学报;2008年01期
14 曾磊;王晓毅;;非内皮细胞在血管瘤生长周期中的作用[J];国际口腔医学杂志;2008年S1期
15 陈娟;周洁;谢秋红;段秋红;从容;冯友梅;;DDPH对低氧内皮细胞条件培养液诱导肺动脉平滑肌细胞增殖及α-S M-actin表达的影响[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2005年05期
16 房良敏,杨秦飞,穆皓;窦房结自律细胞对低氧的耐受性[J];基础医学与临床;1986年05期
17 杨文波,孙仁宇,严仪昭,张宏;间断低氧大鼠谷胱甘肽过氧化物酶及还原型谷胱甘肽的变化[J];基础医学与临床;1992年05期
18 周兆年,王利华,袁锋,姜楞,潘翠珍,何军;长期居住海平后藏族经受急性减压低氧时的心泵和呼吸功能[J];科学通报;1992年03期
19 孙朝阳,徐德门 ,李启明 ,赵正海 ,余忠跃;癌症患者佩戴低氧呼吸装置的血气分析[J];中华放射肿瘤学杂志;1993年01期
20 王勤,沈剑敏,周其全,梁少杰;低氧失血性休克早期红细胞免疫功能对红细胞流变性的影响[J];兰州大学学报(自然科学版);1993年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 汪璇;张振兴;吴海涛;王月;赵彤;刘淑红;范明;王晓民;;低氧对成年大鼠脑内神经干细胞增殖和分化的影响[A];中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会论文摘要汇编[C];2005年
2 熊吉信;刘兆轩;刘小春;杨春江;;小鼠胚胎干细胞体外定向分化为血管平滑肌细胞的实验研究[A];2009全国中西医结合周围血管疾病学术交流会论文集[C];2009年
3 付全花;李晔;李钢;沈海刚;王凯诚;;PDGF-BB和TGF-β1诱导人脂肪干细胞向血管平滑肌细胞分化的研究[A];2008年浙江省血管外科年会论文汇编[C];2008年
4 王建;马丽;张洪菊;金薇娜;蔺亚妮;常国强;王立洪;李华文;庞天翔;;细胞酸碱内环境对低氧诱导的白血病细胞分化的影响及相关机制研究[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
5 张博;李志超;董明清;;RANA编辑酶ADAR1在低氧性PASMCs增殖中的作用[A];中国生理学会2007年消化内分泌生殖学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年
6 杜继曾;陈学群;张颖沙;刘健翔;许宁一;张家兴;;低氧下生长发育抑制与认知功能促进的调节机制[A];中国生理学会第五届比较生理学学术会议论文汇编[C];2004年
7 熊吉信;刘兆轩;刘小春;杨春江;;鼠胚胎干细胞体外定向分化为血管平滑肌细胞的实验研究[A];中国中西医结合学会周围血管疾病专业委员会周围血管疾病学术会议论文集[C];2007年
8 唐嘉茵;刘东华;罗晓禾;赵丹;刘慧雯;;HIF-1α对小鼠耳缘成纤维细胞组蛋白乙酰化的影响[A];中国解剖学会2011年年会论文文摘汇编[C];2011年
9 何敬全;赵娟娟;董其平;柴真;;低氧后HIF-1α和VEGF在皮层和海马星形胶质细胞中具有不同的表达水平[A];“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要[C];2009年
10 裴建明;王跃民;马恒;黄德明;;不同时间低氧后心肌细胞钙瞬变的变化[A];中国生理学会第21届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 揭伟;循环平滑肌祖细胞在低氧性肺无肌细动脉肌化中的作用[D];华中科技大学;2009年
2 沈凌;黄芪对低氧环境下血管内皮细胞生长因子/基质细胞衍生因子-1诱导人骨髓间充质干细胞分化、迁移的干预作用的研究[D];北京中医药大学;2010年
3 金晓立;低氧环境调控下的骨髓间充质干细胞改善胰岛移植物功能的实验研究[D];浙江大学;2010年
4 朱清;肾素-血管紧张素系统及其阻断剂对血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化中的作用机理的研究[D];山东大学;2003年
5 耿庆信;糖尿病大鼠动脉损伤后新生内膜形成及冠心病合并糖尿病患者血管内皮功能的研究[D];山东大学;2004年
6 王志高;加味桃核承气汤不同配伍组方及提取方法对糖尿病血管平滑肌细胞增殖、凋亡的影响[D];广州中医药大学;2007年
7 彭侃夫;AOPP对血管平滑肌细胞MCP-1表达及其信号通路的研究[D];第三军医大学;2006年
8 张园;重组人组织因子腺病毒干扰载体的构建及其转染人血管平滑肌的体外研究[D];南方医科大学;2008年
9 吴江群;骨髓基质干细胞体内成骨分化研究[D];中国协和医科大学;2008年
10 高宇;血浆尾加压素Ⅱ水平在相关疾病中变化的临床和基础研究[D];吉林大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李晓娜;FHL-1在低氧肺血管平滑肌细胞中的表达[D];华中科技大学;2009年
2 郝淑玲;肾上腺髓质素对低氧和转化生长因子β1促成纤维细胞增殖、胶原合成的影响及机制[D];第三军医大学;2004年
3 侯振海;单纯低氧及低氧复合运动对骨骼肌影响的实验研究[D];第一军医大学;2004年
4 李津娜;慢性阻塞性肺疾病患者睡眠低氧的影响因素的研究[D];天津医科大学;2004年
5 郭海涛;血管钠肽对低氧促心成纤维细胞生长的抑制作用及其机制[D];第四军医大学;2001年
6 徐彩霞;湿热环境下烫伤兔早期低氧血症的实验研究[D];第一军医大学;2004年
7 王晖;低氧预适应对小鼠有氧运动能力的影响[D];华东师范大学;2004年
8 蒋威;体外诱导脂肪干细胞向血管平滑肌细胞分化的实验研究[D];昆明医学院;2008年
9 鲁沈源;慢性间歇低氧和复氧对非肥胖型大鼠糖代谢的影响[D];复旦大学;2010年
10 赵彤;低氧对神经干细胞增殖和代谢的影响及miR-21的表达和作用的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 岳阳;我国学者初建HIF-1α介导白血病细胞分化新理论[N];中国医药报;2006年
2 记者 施嘉奇 通讯员 王姿英;探索中药对干细胞分化的作用[N];文汇报;2009年
3 王姿英;中英合作中药调控干细胞分化研究启动[N];中国医药报;2009年
4 陈超;科学家发现引发细胞分化的分子通道[N];科技日报;2010年
5 北京体育大学科研中心教授 胡扬;低氧运动也很棒[N];健康报;2010年
6 米力汪;白血病细胞分化机理新理论[N];科技日报;2006年
7 胡德荣;低氧环境诱导急粒白血病细胞系分化[N];健康报;2006年
8 汪敏 仇逸;低氧能够诱导白血病细胞分化[N];新华每日电讯;2003年
9 汪敏 仇逸;科学家提出低氧能够介导白血病细胞分化[N];中国高新技术产业导报;2003年
10 汪敏 仇逸;低氧利于诱导白血病细胞分化[N];中国医药报;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978