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围术期心肌胰岛素抵抗的发生及机制的研究

王珏  
【摘要】: 第一部分高胰岛素诱导大鼠离体心脏胰岛素抵抗模型的建立 目的观察10、20、30、50U/L浓度胰岛素对离体大鼠心肌葡萄糖代谢的影响,建立离体大鼠心肌胰岛素抵抗模型。 方法30只SD大鼠随机分为5组,建立Langendorff模型后,以含有不同浓度胰岛素的K-H液进行离体心脏灌注,时间为60min。其中对照组不含胰岛素,实验组为超生理浓度胰岛素,分别为10、20、30、50U/L。分别于灌注30min和60min时收集冠脉流出液样本,采用葡萄糖氧化法检测冠脉流出液中的葡萄糖浓度,计算心肌葡萄糖摄取量,以评估高浓度胰岛素对心肌组织葡萄糖消耗的影响。 结果灌流30min时,胰岛素刺激组大鼠心肌组织葡萄糖净摄取量分别为1.72±0.26mmol/L,1.59±0.23mmol/L,1.56±0.16mmol/L,1.39±0.27mmol/L,较对照组2.73±0.21 mmol/L明显减少。60min灌流结束时,心肌组织葡萄糖摄取进一步减少,胰岛素刺激组分别为1.59±0.21 mmol/L,1.49±0.18mmol/L,1.38±0.20mmol/L,1.23±0.22mmol/L,对照组为2.63±0.19mmol/L。结果表明,胰岛素刺激30min和60min时,胰岛素刺激组大鼠心肌组织对葡萄糖的摄取随着胰岛素浓度上升而逐渐减少,结果有显著意义(P<0.05)。 结论10、20、30、50U/L胰岛素刺激离体大鼠心脏60min后,心肌组织对葡萄糖摄取减少,对胰岛素的作用出现抵抗。 第二部分胰岛素诱导离体心脏发生胰岛素抵抗时心肌损伤的研究 目的观察高浓度胰岛素刺激离体心脏发生胰岛素抵抗后心肌组织损伤的情况。 方法30只SD大鼠随机分为五组,建立Langendorff模型后,以含有不同浓度胰岛素的K-H液进行离体心脏灌注,时间为60min。其中对照组不含胰岛素,实验组为超生理浓度胰岛素,浓度分别为10、20、30、50U/L。观察心率(HR),收缩期和舒张期左心室内压最大变化速率,于灌注60min时收集冠脉流出液样本,检测肌酸激酶(CK),肌钙蛋白I(cTnI)含量;60min灌注完毕后留取心肌组织,TUNEL检测心肌细胞凋亡情况;光镜和电镜下分别观察心肌组织结构改变。 结果(1)灌注60min后,各胰岛素刺激组心脏左心室-dp/dt_(max)较对照组明显降低(P<0.01),左心室+dp/dt_(max)也呈降低趋势,但无统计学意义,而HR无明显改变,表明经过60min高浓度胰岛素刺激后,心脏受到损伤,心功能降低,以舒张功能受损为主。(2)60min灌流结束时,随着胰岛素刺激浓度增加,各胰岛素刺激组冠脉流出液中CK和cTnI蛋白含量较对照组明显增加(P<0.01)。冠脉流出液中CK和cTnI的水平明显升高,表明心肌释放心肌酶和cTnI增加,心肌受到损伤。(3)TUNEL测定结果显示高胰岛素刺激组心肌组织阳性细胞数增加,AI值(凋亡指数)明显升高(P<0.01),心肌细胞凋亡增加。(4)光镜下可见10U/L胰岛素刺激组心肌纤维排列紊乱,水肿程度高于对照组,进一步观察超微结构可见10U/L.胰岛素刺激组心肌细胞肿胀,肌纤维排列紊乱,线粒体密度降低,部分出现肿胀,嵴断裂甚至消失,表明10U/L浓度胰岛素刺激离体心脏60min后,心肌发生病理改变。 结论10、20、30、50U/L胰岛素刺激离体大鼠心脏60min后,心肌发生胰岛素抵抗,心功能降低,释放心肌酶增加,心肌细胞凋亡增多,发生病理改变,心肌受到了损伤。 第三部分胰岛素诱导的离体心脏胰岛素抵抗机制的研究 目的从受体前、受体及受体后探讨高浓度胰岛素刺激离体大鼠心脏后心肌胰岛素抵抗的发生机制。 方法30只SD大鼠随机分为五组,建立Langendorff模型后,以含有不同浓度胰岛素的K-H液进行离体心脏灌注,时间为60min。其中对照组不含胰岛素,实验组为超生理浓度胰岛素,浓度分别为10、20、30、50U/L。60min灌注完毕后留取心肌组织,RT-PCR检测心肌组织胰岛素受体(InsR)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)mRNA表达;Western blot检测心肌组织胰岛素受体(InsR)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)表达;免疫组化检测心肌组织eNOS和ET-1表达。 结果(1)RT-PCR检测心肌组织胰岛素受体mRNA表达,结果显示胰岛素刺激组较对照组明显降低(P<0.01);Western blot结果显示InsR蛋白表达与mRNA变化一致,较对照组明显减少,其差异有极显著意义(P<0.01)。表明高浓度胰岛素刺激离体大鼠心脏60min后,心肌组织InsR mRNA和蛋白表达均随胰岛素刺激浓度增高而降低。(2)胰岛素刺激组GLUT-4 mRNA较对照组明显降低(P<0.01);Wester blot检测发现蛋白含量也相应减少,差异有极显著意义(P<0.01)。表明经过高浓度胰岛素60min刺激引起心肌组织GLUT-4的mRNA和蛋白表达下调,葡萄糖转运减少,心肌组织摄取葡萄糖降低。(3)eNOS和ET-1蛋白免疫组化检测结果,10U/L胰岛素刺激组eNOS蛋白表达低于对照组(P<0.01);而ET-1蛋白表达高于对照组(P<0.01)。表明10U/L胰岛素刺激60min后,心肌组织eNOS表达降低而ET-1升高,eNOS与ET-1平衡被破坏,内皮功能出现障碍,冠脉收缩,血流量减少,引起胰岛素、葡萄糖向间质转运减少,代谢终产物堆积,加重心肌组织IR。 结论10、20、30、50U/L胰岛素刺激离体大鼠心脏60min后,心肌内皮发生功能障碍,心肌组织InsR和GLUT-4表达减少,受体前、受体及受体后均发生了改变,导致心肌发生胰岛素抵抗。 第四部分胰岛素诱导的体外培养心肌细胞胰岛素抵抗的研究 目的采用胰岛素诱导体外原代培养的心肌细胞的方法,建立胰岛素抵抗的心肌细胞模型,并观察10~(-6)mol/L胰岛素对心肌细胞胰岛素受体的影响及病理学改变。 方法采用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法体外分离培养和纯化新生大鼠心室肌细胞,以不同浓度胰岛素干预24h,其中对照组不含胰岛素,实验组为超生理浓度胰岛素,分别为10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)mol/L;将干预后的心肌细胞用不含血清的培养基孵育24h,留取上清液,葡萄糖氧化法检测上清液中的葡萄糖含量;~3H-D-葡萄糖掺合实验检测10~(-6)mol/L胰岛素组和空白对照组心肌细胞的葡萄糖掺合率,以评估胰岛素敏感性;RT-PCR检测心肌细胞中胰岛素受体mRNA含量;Western blot检测心肌细胞中InsR蛋白含量;电镜观察心肌细胞超微结构变化。 结果(1)胰岛素刺激24h后,随着胰岛素浓度由10~(-8)mol/L增加到10~(-6)mol/L,各胰岛素刺激组心肌细胞葡萄糖消耗量减少,但当胰岛素刺激浓度由10~(-6)mol/L继续增加到10~(-5)mol/L时,葡萄糖消耗量减少不明显,表明以高浓度胰岛素刺激心肌细胞24h后,心肌细胞摄取利用葡萄糖减少,对胰岛素的作用产生了抗性,最佳干预浓度为10~(-6)mol/L。(2)加入胰岛素后,10~(-6)mmol/L胰岛素组细胞的~3H-D-葡萄糖掺入率在各种浓度的胰岛素刺激下均显著低于对照组细胞(P<0.01),并且10~(-6)mmol/L胰岛素组和对照组细胞的葡萄糖掺入率随着胰岛素浓度的升高而升高,呈浓度依赖性(3)10~(-6)mmol/L胰岛素组心肌细胞InsR mRNA和蛋白表达均减少,表明10~(-6)mmol/L胰岛素干预24h后心肌细胞IsnR表达下调(P<0.01)。(4)电镜下可见10~(-6)mol/L胰岛素组心肌细胞明显肿胀,胞核固缩,部分胞质内出现空泡,线粒体肿胀,部分嵴断裂甚至消失,超微结构发生明显病理改变。 结论采用高胰岛素诱导培养法可以诱导心肌细胞发生胰岛素抵抗,最佳干预浓度为10~(-6)mmol/L,心肌细胞InsR mRNA和蛋白水平均下调,超微结构受到损伤。


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