促红细胞生成素拮抗血管紧张素Ⅱ诱导的乳鼠心肌细胞肥大的研究

【摘要】： 研究背景和目的 心肌肥厚是临床上许多心血管疾病共有的病理过程，它是心肌长期负荷过度引起的一种适应性病理改变。虽然初期心肌肥厚是一种有益的代偿反应，以求平衡心肌应激的增加，但长期应激所致的持续性心肌肥厚最终可导致心肌病、心衰、心律失常，甚至猝死。越来越多的证据支持改善心室重构能改善患者的生存预后。 促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一类由缺氧诱导的促血细胞生成的激素，并已被广泛应用于临床。随着促红细胞素受体在心血管系统中被发现，EPO造血以外的心肌保护功能引起了人们的关注。基础研究已证实EPO是一个多效细胞因子，在心血管系统中具有抗凋亡和组织保护作用。有一个令人关注的现象是，动物实验和临床试验发现EPO还具有抑制心室肥大、逆转心室重构和改善心功能的作用。虽然这些益处部分可能来源于EPO的促造血功能，但EPO对心肌细胞的直接作用也应该给予考虑。然而，目前尚无研究报道EPO与心肌细胞肥大关系之间的研究，是否存在EPO对心肌肥大的直接抑制也有待于进一步探讨。这将对治疗心力衰竭、改善心室重构和开发EPO的新用途具有重要的临床意义。 一氧化氮(nitric oxide，NO)是一类重要的心室重构调节因子。小剂量释放的内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)来源的NO能够有效的抑制心肌细胞肥大、逆转心室重构和心室扩张。以往的研究报道EPO能通过激活phosphatidylinositol 3’-kinase(PI3K)-蛋白激酶B(Akt[PKB])促进eNOS表达及活化，从而导致NO释放。但是，目前有关EPO的PI3K-Akt-eNOS-NO信号通路与心肌细胞肥大之间的研究仍未见报道。 此外，还有报道发现EPO具有抗炎作用，能够抑制衰竭心脏中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、白介素1β(interleukin-1beta)、白介素6(interleukin-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alfa)等炎症因子的表达。而TGF-β1即是参与心肌肥大的一类最重要的细胞因子，它可以通过激活它的下游分子信号Smad2、Smad3等发挥作用。因此，我们有理由推测EPO可通过下调TGF-β1的表达而发挥其抗心肌细胞肥大作用。 基于以上考虑，本研究拟从PI3K-Akt-eNOS-NO和TGF-β1-Smad2两条信号途径出发探讨EPO对肥大心肌细胞的影响。本研究用血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)诱导心肌细胞肥大，观察EPO对其的影响。结合相关信号分子抑制剂的使用，同时检测信号通路中各分子的表达，以探讨其可能机制。 第一部分乳鼠心肌细胞的分离、培养及鉴定 目的探索稳定、可靠地分离、纯化和培养乳鼠心肌细胞的方法。 方法剪碎乳鼠心室肌组织，采用Ⅰ型胶原酶消化分离乳鼠心肌细胞，差速贴壁法和5-溴脱氧尿苷(5-BrdU)相结合纯化心肌细胞。采用α-actin抗体进行免疫组化鉴定心肌细胞。 结果①接种半小时后，可见部分心肌细胞贴壁；24小时后可见部分单个的心肌细胞搏动；48小时后可见大部分心肌细胞相互连接，成簇跳动。②α-actin抗体免疫组化染色后可见培养的细胞均是心肌细胞。 结论本实验室运用的培养心肌细胞的方法稳定、可靠，能成功分离出纯化的心肌细胞。 第二部分促红细胞生成素对乳鼠心肌细胞肥大及PI3K／Akt-eNOS信号转导通路的影响 目的探讨促红细胞生成素(EPO)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肥大心肌细胞的影响，以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)／丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)-内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号转导通路在其中的作用。 方法分离乳鼠心肌细胞，利用AngⅡ诱导建立心肌细胞肥大模型，以心肌细胞表面积和心钠素(ANF)mRNA表达作为心肌细胞肥大观察指标。观察不同浓度EPO对肥大心肌细胞的影响，并利用PI3K抑制剂LY294002和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME对其相关机制进行探讨，同时对细胞培养液中一氧化氮(NO)浓度进行检测，蛋白免疫印迹法检测磷酸化Akt(p-Akt)、Akt、磷酸化eNOS (p-eNOS)和eNOS蛋白表达情况。 结果20 U／ml EPO能抑制由AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，表现为心肌细胞表面积和ANF mRNA表达均减少(P＜0．05)。EPO能激活Akt，促进eNOS及p-eNOS表达增加(均P＜0．05)，并使NO合成增加(P＜0．01)。LY294002和L-NAME能逆转EPO的抗心肌细胞肥大作用，减少NO产量(P＜0．05)。蛋白免疫印迹法检测显示，LY294002能够抑制EPO对p-Akt、p-eNOS和eNOS蛋白表达的促进作用，而L-NAME能抑制eNOS的磷酸化(均P＜0．05)。 结论EPO能够抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，该作用可能是通过激活PI3K／Akt信号转导通路，促进eNOS表达与活化，从而促进NO的合成来实现的。 第三部分TGF-β1-Smad2信号转导通路在促红细胞生成素抗心肌细胞肥大中的作用 目的探讨TGF-β1-Smad2信号转导通路在促红细胞生成素(EPO)抗乳鼠心肌细胞肥大中的作用。 方法体外分离培养乳鼠心肌细胞，采用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激建立肥大心肌细胞模型，实验分为对照组、单纯AngⅡ刺激组、EPO(U／ml)干预组，以细胞表面积和心钠素(ANF)mRNA表达作为细胞肥大的观察指标，采用Western blot方法检测细胞内信号分子转化生长因子β1(TGF-β1)及其下游分子信号Smad2蛋白表达与活化(p-Smad2)情况。 结果20U／ml的EPO能有效逆转AngⅡ诱导的心肌细胞肥大；与单纯AngⅡ刺激组比较，EPO能减弱促心肌细胞肥大信号分子TGF-β1及其下游分子信号Smad2和p-Smad2蛋白表达(均P＜0．05)。 结论TGF-β1-Smad2信号转导通路参与介导EPO的抗乳鼠心肌细胞肥大作用。