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叶酸修饰壳聚糖小干扰RNA纳米粒靶向逆转卵巢癌多药耐药的研究

杨琰  
【摘要】: 第一部分叶酸-壳聚糖复合载体的制备及性质鉴定 目的合成叶酸修饰壳聚糖复合载体,并鉴定叶酸-壳聚糖复合载体的成功合成,测定叶酸偶联率。 方法1.用还原酰胺化法合成叶酸修饰壳聚糖复合载体;2.通过对合成样本的红外光谱测定,确认叶酸修饰壳聚糖复合载体;3.紫外扫描确定叶酸成功偶联于壳聚糖;4.通过对比FA浓度-吸光度标准曲线,测定叶酸偶联率。 结果1.获得了纯化的叶酸修饰壳聚糖复合载体,为淡黄色细致均匀的粉末,溶液为无味,淡黄色透明液体;2.红外吸收光谱显示叶酸修饰壳聚糖复合载体在1563cm~(-1)处出现新的特征性-CO-NH-振动波,说明-CO-NH-键成功在叶酸和壳聚糖间形成;3.紫外吸收光谱显示叶酸修饰壳聚糖复合载体在280nm处出现宽大吸收波,此为叶酸的特征性紫外吸收波长,证实叶酸成功与壳聚糖偶联;4.叶酸浓度在5.2-30.9μg/mL范围内与叶酸吸光度(A)呈良好的线性关系。回归方程为A=0.0127C+0.0016,R~2=0.9983。通过改变叶酸及壳聚糖不同的反应比,得到不同的叶酸偶联率,共合成四种不同偶联率的叶酸修饰壳聚糖复合载体,分别是3%、7%、11.2%和17%。 结论通过还原胺法成功合成叶酸修饰壳聚糖复合载体,在加入不同比例反应物后,共合成4种不同叶酸偶联率的叶酸修饰壳聚糖复合载体。提示可以利用与壳聚糖分子上的活性氨基的化合反应,成功修饰壳聚糖,改变其物理化学性能。 第二部分叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒的制备及性质检测 目的合成叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒,并测定其形态及直径大小。研究纳米粒对不同细胞的毒性及保护DNA免受降解的功能。 方法1.采用复凝聚法合成叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒(FA-CS-PshRNA)和壳聚糖pshRNA纳米粒(CS-PshRNA);2.透射电镜观察纳米粒形态、大小,并测定不同叶酸偶联率下,纳米粒的平均直径;3.酶保护实验检测不同纳米粒对质粒DNA的成功包裹及保护功能;4.MTT法检测纳米粒对于不同妇科肿瘤细胞系(SKOV3、A2780、CAOV3、HeLa和MCF-7)产生的毒性;5.选择叶酸高表达的卵巢癌细胞系SKOV3,乳腺癌细胞系MCF-7和宫颈癌细胞系HeLa作为实验细胞,在体外培养过程中导入叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒,荧光倒置显微镜下观察细胞形态及绿色荧光蛋白表达量,流式细胞仪检测不同细胞的转染效率。 结果1.本研究通过复凝聚法,成功合成了叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒和壳聚糖PshRNA纳米粒,纳米粒溶液为透明、无色、无味溶液;2.透射电镜显示纳米粒为近似球型,表面光滑、均质的纳米粒颗粒。壳聚糖PshRNA纳米粒粒径为138.4±0.7nm,叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒(叶酸偶联率:3%、7.5%、11.2%和17%)直径依次为289.6±0.7nm、78.1±0.3nm、186.6±0.6nm和212.2±0.5±nm;3.酶保护实验结果表明壳聚糖及叶酸修饰壳聚糖皆能有效结合和浓缩DNA形成相应纳米粒,壳聚糖及叶酸修饰壳聚糖皆能保护DNA不受DNAaseI的降解;4.细胞毒性实验显示叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒和壳聚糖PshRNA纳米粒对于不同细胞系亦有不同毒性。经壳聚糖PshRNA纳米粒处理后,MCF-7、A2780、CAOV3、SKOV3和HeLa的细胞活力分别是处理前的87.9±2.4%、91.4±1.0%、42.9±2.1%、102.0±4.0%和97.4±1.1%,而经叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒处理后,上述细胞的细胞活力分别为处理前的63.0±2.5%、90.6±1.3%、50.5±0.7%、106.5±1.8%和99.3±1.6%;5.对于MCF-7,SKOV3细胞系,叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒转染效率(16.8±1.2%和24.3±0.7%)明显高于壳聚糖PshRNA纳米粒(0.3±0.1%和0.7±0.1%)(P<0.05),壳聚糖PshRNA纳米粒和叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒对于HeLa细胞的转染效率分别为4.2±0.4%和4.8±0.9%,二者无统计学差异(P>0.05)。 结论通过复凝聚法成功合成叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒和壳聚糖PshRNA纳米粒。不同叶酸偶联率影响纳米粒直径大小,在7.5%的叶酸偶联率下,纳米粒直径最小(78.1±0.3nm)。叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒和壳聚糖PshRNA纳米粒皆能稳定包裹质粒DNA,并能保护其免受DNAaseⅠ的酶解。在叶酸介导下,叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒的转染效率明显高于壳聚糖PshRNA纳米粒。提示通过叶酸修饰,明显提高了壳聚糖PshRNA纳米粒的转染效率。 第三部分卵巢癌SKOV3耐药细胞株建立及耐药性的研究 目的培养经泰素诱导SKOV3多药耐药细胞株,检测MDR1编码蛋白P-gp在SKOV3亲本株和耐药株中的表达差异,探讨MDR1基因表达与多药耐药的相关性。为研究靶向MDR1的叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒逆转卵巢癌多药耐药提供细胞学基础。 方法1.以泰素为诱导剂,采用体外浓度梯度递增法建立卵巢癌SKOV3-ts多药耐药细胞株;2.MTT法检测SKOV3亲本株和耐药株中对紫杉醇和阿霉素的IC_(50)的改变;3.Western-blot和激光共聚焦法检测SKOV3亲本株和耐药株中P-gp蛋白的表达差异。 结果1.本章通过浓度梯度递增法成功建立了卵巢癌SKOV3多药耐药细胞株SKOV3-ts。该细胞株由体积相对较小的梭型变为体积膨胀的不规则形状,有些细胞呈星状和分支状结构,较SKOV3细胞大;2.应用半定量Western-blot检测出在SKOV3-ts及SKOV3细胞系中P-gp的表达量分别是1.15±0.02、0.08±0.01,差异有统计学意义(P<0.05)。激光共聚焦法显示SKOV3细胞中只有微量P-gp表达,而SKOV3-ts细胞的细胞膜上显示较强P-gp的表达;3.SKOV3和SKOV3-ts对紫杉醇的IC_(50)分别是0.0048±0.0002和0.3957±0.0075,差异有统计学意义(P<0.05),对阿霉素的IC_(50)分别是0.0066±0.0006和0.2210±0.0046,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论通过浓度梯度递增法成功建立了卵巢癌SKOV3多药耐药细胞株SKOV3-ts,耐药细胞SKOV3-ts的P-gp表达量明显高于亲本细胞系SKOV3,对紫杉醇和阿霉素的IC_(50)较亲本细胞有明显升高。提示MDR1的过度表达与SKOV3细胞的多药耐药的产生有明显相关性,SKOV3-ts细胞耐药可对阿霉素产生交叉耐药,同时获得细胞膜P-gp高表达。故SKOV3-ts细胞可以作为卵巢癌耐药细胞模型,用作叶酸受体介导的纳米靶向修饰逆转卵巢癌多药耐药的研究。 第四部分叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒靶向逆转SKOV3-ts细胞耐药的研究 目的检测叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒与壳聚糖siRNA纳米粒对SKOV3-ts细胞系MDR1表达的影响,探讨经叶酸修饰后,纳米粒逆转SKOV3-ts细胞系耐药性的改变。 方法1.在SKOV3-ts细胞体外培养过程中导入叶酸修饰壳聚糖PshRNA纳米粒和壳聚糖PshRNA纳米粒,其中PshRNA为可表达靶向MDR1基因的siRNA的真核表达质粒,故而称为叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒和壳聚糖siRNA纳米粒;2.RT-PCR法检测纳米粒转染SKOV3-ts细胞前后,MDR1mRNA表达改变;3.用Western-blot法检测纳米粒转染SKOV3-ts细胞前后,MDR1编码蛋白P-gp的表达改变;4.MTT法检测纳米粒转染SKOV3-ts细胞前后,对紫杉醇耐药IC_(50)的改变。 结果1.半定量RT-PCR检测出壳聚糖siRNA纳米粒与叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒转染SKOV3-ts细胞后,MDR1mRNA表达量分别是0.75±0.01、0.27±0.01,差异有显著意义(P<0.05);2.半定量Western-blot法检测出壳聚糖siRNA纳米粒与叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒转染SKOV3-ts细胞后,P-gp表达量分别是0.62±0.01、0.12±0.01,差异有显著意义(P<0.05);3.MTT法检测壳聚糖siRNA纳米粒与叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒转染SKOV3-ts细胞后,针对PTX的IC_(50)分别为0.3830±0.0096和0.0353±0.0006,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论通过叶酸靶向修饰,叶酸修饰壳聚糖siRNA纳米粒能有效降低靶细胞SKOV3-ts的靶基因MDR1的mRNA和蛋白P-gp表达。逆转SKOV3-ts细胞针对PTX的IC_(50),能有效治疗卵巢癌细胞基于MDR1诱导的多药耐药。


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