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MCMV感染对神经干细胞分化和细胞周期进程的影响及其机制研究

罗丹  
【摘要】: 【目的】 ①在体外细胞水平研究巨细胞病毒感染对神经干细胞(NSCs)分化的影响及其机制; ②探讨巨细胞病毒感染对神经干细胞Wnt信号途径分化相关基因转录水平的影响; ③研究巨细胞病毒感染对神经干细胞细胞周期蛋白cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE和细胞周期进程的影响并探讨其机制。 【方法】 ①小鼠神经干细胞的分离培养、鉴定和分化潜能的检测:剖宫取出孕13.5d的BALB/c胎鼠脑组织,制备单细胞悬液,过滤后用含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培养基培养;传4~5代后用nestin免疫荧光鉴定;用添加2%胎牛血清的DMEM/F12分化培养基(不含EGF、bFGF和B27)诱导NSCs分化,7天后采用免疫荧光法检测(nestin)、神经元特异性烯醇酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 ②MCMV感染NSCs分化培养模型的建立:用感染复数(MOI)分别为5、1和0.1的MCMV感染NSCs,并改用分化培养基进行分化培养。 ③观察MCMV感染分化培养NSCs形态学的变化并示踪感染过程:采用免疫荧光法分别于分化培养后3d、6d、9d、12d、15d、18d和21d观察NSCs及其分化细胞标记物nestin、GFAP和NSE表达的变化,并用MCMV EA示踪感染过程。 ④MCMV感染对NSCs分化细胞比率的影响:采用流式细胞术分别于分化培养后3d、6d和9d检测NSCs及其分化细胞比率的变化。 ⑤MCMV感染对NSCs Wnt信号途径分化相关基因mRNA表达的影响:采用Real-time PCR法检测分化培养后0.5、1、2、3、4和5d时NSCs Wnt信号途径上游基因Wnt-3、Wnt-7a和下游基因Ngn-2、c-myc及CyclinD1 mRNA水平的动态变化。 ⑥MCMV感染对NSCs cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE和细胞周期进程的影响:用感染复数(MOI)分别为5、1和0.1的MCMV感染NSCs,并用含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培养基继续培养,采用Cyclins/DNA双参数流式细胞术检测感染细胞cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE的表达和细胞周期时相的动态变化。 【结果】 ①成功体外分离培养NSCs,NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记nestin表达阳性,并可进一步分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。 ②分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,甚至崩解死亡;细胞nestin表达下调缓慢,显著高于对照组,GFAP和NSE表达显著低于对照组(P0.05),分化细胞中可检测到MCMV EA(早期抗原)的阳性表达。 ③分化培养后3~9d,感染组Nestin阳性细胞比率均显著高于对照组(P0.05),而GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于对照组(P0.05),并随MOI增加差异越明显。 ④分化培养后,感染组Wnt-3 mRNA的表达水平在第1~2d显著低于正常对照组(P0.05),其后逐渐升高但未超过正常水平;感染组Wnt–7a和Ngn-2 mRNA水平分别在第0.5~2d和第1d明显低于正常组(P0.05),均至第3d开始升高,但其总体峰值水平均低于正常组;感染组c-myc mRNA水平在第1~4d显著低于正常组(P0.05);感染组CyclinD1 mRNA水平在第0.5~1d明显低于正常组,在第2d(MOI=5)和第3d(MOI=5、1、0.1)高于正常组(P0.05);这五种基因表达变化的幅度随MOI的增加而增大。 ⑤感染后,NSCs cyclinA、cyclinB1、cyclinD1和cyclinE的表达均上调,其中MOI=0.1表达逐渐上升,在第6d达峰值,MOI=1组表达高峰在第4d,MOI=5组表达高峰在第3d;感染组G0/G1期细胞比率减少,S期和G2/M期细胞比率显著增加,出现S期和G2/M期阻滞,并随MOI的增加变化越明显。 【结论】 ①MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少,分化发育过程中的神经元和星形胶质细胞对MCMV易感。 ②MCMV可下调NSCs Wnt信号途径分化相关基因Wnt-3、Wnt-7a、Ngn-2、c-myc的表达并干扰CyclinD1基因表达,这可能是MCMV感染抑制NSCs分化的重要作用机制。 ③MCMV抑制NSCs分化的效应及对其Wnt信号途径分化相关基因表达的影响与MOI大小存在一定量效依赖关系,MCMV可通过干扰分化相关基因的表达来抑制NSCs分化,可能与CMV感染致脑发育异常密切相关。 ④MCMV可上调cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE的表达,诱导NSCs从G0/G1期进入S期,出现S期和G2/M期偏移和阻滞,影响NSCs细胞周期进程,并与MOI存在一定量效依赖关系,这可能是CMV抑制NSCs增殖的主要原因。 ⑤CMV感染对NSCs细胞周期进程和分化的抑制作用可能是先天性CMV感染致脑发育异常的重要机制。


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1 张英;巨细胞病毒感染对学习记忆的影响及钙信号系统在其发生机制中的作用[D];华中科技大学;2006年
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