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多疣壁虎GFAP基因的克隆及其脊髓横断损伤后GFAP的表达变化

高德宏  
【摘要】: 星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞,也是胶质细胞中体积最大的一种。创伤、缺血、感染、中毒、中枢神经系统(CNS)自身免疫性疾病等各种因素造成的CNS损伤中,皆可导致星形胶质细胞增生,以GFAP的急剧上调为其特点,表现为星形胶质细胞增生肥大、迁移至病灶并最终形成胶质瘢痕。GFAP--星形胶质细胞的骨架蛋白,是星形胶质细胞的标志物,因而被认为是中枢神经系统损伤中标记反应性星形胶质细胞的敏感且可靠的指标。 脊髓损伤可导致神经通路中断、神经元受损和继发性脊髓损伤。由于神经组织结构的特殊性以及损伤导致的一系列病理变化,使得脊髓再生和功能恢复非常困难。各国神经科学家正在努力不懈地攻克这一医学上的难题,以造福人类。目前对于脊髓横断性损伤的修复仍有大量研究需要探究。反应性星形胶质细胞增生是中枢神经组织损伤后的修补愈合反应,可通过细胞间的紧密连接和缝隙连接相互交织成网状而形成瘢痕组织,但瘢痕组织也抑制了CNS损伤后轴突的再生。 由于壁虎等低等脊椎动物脊髓损伤后具有再生能力,因此探讨高等脊椎动物脊髓再生的一个可行性的思路就是通过研究具有脊髓再生能力的低等动物脊髓再生的现象,深入了解其允许脊髓再生的内在机制,为高等动物脊髓再生提供有价值的线索。研究报道,壁虎星形胶质细胞数量稀少。这是否提示在壁虎脊髓再生中星形胶质细胞反应可能较弱呢?这是一个非常有趣的科学问题且至目前尚无人报导证实。而以往的研究也表明,在哺乳动物及人类,脊髓损伤后伴有强烈的胶质细胞反应,并认为这是阻碍脊髓再生的原因之一。因此,探讨壁虎脊髓横断损伤后反应和再生的独特机制对研究高等哺乳动物乃至人类的脊髓再生都有更直接的启示作用,而利用壁虎建立一个稳定可靠,重复性强的脊髓损伤模型,是研究其脊髓再生机理的必要前提。 为了探明星形胶质细胞与壁虎脊髓损伤和再生的关系,本实验以GFAP作为壁虎星形胶质细胞的标志物,采用基因克隆、实时定量PCR、Western Blot、免疫荧光组织化学法等方法,研究壁虎脊髓横断损伤后的星形胶质细胞反应状况。为揭示壁虎脊髓横断损伤后反应和再生的独特机制提供实验依据。为人类脊髓损伤康复治疗启迪思路。 由于目前尚无有关壁虎GFAP基因的研究报道和商品化的壁虎GFAP抗血清,因此本部分实验拟克隆多疣壁虎GFAP基因,并对其进行生物学分析;自制针对壁虎GFAP蛋白的特异性抗体。为后续研究壁虎星形胶质细胞与脊髓损伤再生的关系提供必要的研究工具。 首先从南通医学院已建立的壁虎cDNA文库当中挑取了GFAP基因序列,但其并不完整(缺5’端),于是我们采用快速cDNA末端扩增(RACE)实验扩增其5’末端,并与文库序列拼接从而得到了壁虎GFAP mRNA的全长序列;通过Northem Blot试验验证壁虎GFAP基因的组织表达;并通过免疫兔子产生针对壁虎GFAP的抗体血清,采用ELISA法测定其抗体效价。结果显示,壁虎GFAP mRNA全长为1770bp,编码446个氨基酸,分子量估计为52 kD;生物学分析显示在已知物种GFAP当中其与红原鸡同源性最高;组织表达谱显示其主要表达于中枢神经系统(脑和脊髓);成功构建壁虎GFAP原核表达质粒pGEX-4T1-gGFAP;成功免疫动物产生了GFAP多克隆抗体,ELISA测定血清效价为1:10000,并且能与壁虎脊髓组织GFAP抗原发生反应,其稀释度可至1:500。结果表明,本实验首次成功克隆了壁虎GFAP mRNA全长基因,并获知其生物学性状;构建了其原核表达载体;并成功制备了针对壁虎GFAP的多克隆抗体,为后续研究壁虎星形胶质细胞与脊髓损伤再生的关系奠定了基础。 为了研究多疣壁虎脊髓横断损伤后GFAP的表达变化,探讨壁虎星形胶质细胞与脊髓再生能力的关系。本实验设计并实施壁虎脊髓横断损伤模型,采用实时定量PCR和Western Blot方法检测GFAP mRNA和蛋白水平的表达变化;采用免疫荧光组织化学法观察增殖的星形胶质细胞其形态及数量的变化。结果显示,在壁虎脊髓横断损伤后GFAP在基因和蛋白的水平上反应类似,即损伤后1天表达即有微量上调,3天到达小高峰,随后开始下降,在2周时接近正常水平;免疫荧光组织化学反应结果显示:在脊髓损伤后GFAP在灰质区无明显增殖,在脊髓白质区的腹侧和两侧,显示为反应性星形胶质细胞肥大、突起增多,但通过对脊髓损伤截面L10以下2 mm脊髓段连续切片的细胞计数统计表明,星形胶质细胞数目无显著性增加。结果提示,多疣壁虎脊髓损伤后星形胶质细胞反应在时间和空间上具有局限性,与哺乳类和人类脊髓损伤后强烈的星形胶质细胞反应截然不同,这种独特的局限性可能有利于壁虎脊髓损伤后的再生。 小结:本实验首次成功克隆了壁虎GFAP mRNA全长基因,获知其生物学性状,应用GST融合蛋白表达系统成功构建了壁虎GFAP原核表达载体并进行体外表达。通过壁虎原核表达的GFAP免疫兔,制备了GFAP多克隆抗血清。为后续研究壁虎星形胶质细胞与脊髓损伤再生的关系提供了研究工具。本研究还表明,壁虎GFAP的基因和蛋白在脊髓横断损伤后1天表达即有上调,3天到达小高峰,随后开始下降,在2周时接近正常水平;免疫荧光组织化学反应结果显示:在脊髓白质区反应性星形胶质细胞突起增多,但细胞数目无明显增加。上述结果表明:在多疣壁虎脊髓损伤后,星形胶质细胞反应在时间和空间上存在很大局限性,与哺乳类和人类脊髓损伤后强烈的星形胶质细胞反应截然不同,这可能是壁虎脊髓损伤后可以获得再生的重要原因之一。


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