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超声微泡介导基因转染防治移植静脉再狭窄的实验研究

胡敏  
【摘要】: 目的探讨超声微泡造影剂结合超声辐照能否提高增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP)在大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的转染效率,及其对细胞活性的影响。 方法实验分为A、B、C、D四组,分别为空白对照组、单纯质粒浸泡组、质粒+超声辐照组、质粒+超声辐照+造影剂组。使用诊断超声仪照射体外培养的大鼠血管平滑肌细胞,辐照条件为超声探头频率为10MHz,机械指数为1.9,辐照时间为10min,添加或不添加超声微泡造影剂,pEGFP浓度为5μg/ml,辐照后台盼蓝染色检测细胞活性(生存率),48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的转染表达率。 结果A、B、C、D四组的细胞生存率分别为(97.43±2.63)%、(97.52±1.64)%、(96.83±2.31)%及(95.21±1.36)%,各组间无显著性差异(P0.05);GFP转染表达率分别为(0.12±0.42)%、(1.31±0.71)%、(4.45±3.13)%及(21.48±2.16)%,D组的GFP转染表达率与其余各组比较差异具有显著意义(P0.01)。 结论造影剂微泡结合超声辐照能显著提高pEGFP在VSMC的转染效率,而对细胞的活性基本无影响,可作为基因转染的一种有效方法。 目的探讨微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧气化氮合成酶(eNOS)基因转染体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的可行性。 方法实验分为A、B、C、D、E五组,分别为空白对照组、单纯质粒浸泡组、质粒+微泡造影剂组、质粒+超声辐照组、质粒+超声辐照+造影剂组。用重组真核表达载体pcDNA3.1-eNOS经微泡造影剂及超声辐照介导转染体外培养的大鼠血管平滑肌细胞,辐照条件为超声探头频率为10 MHz,机械指数为1.9,辐照时间为10min,重组真核细胞表达载体pcDNA3.1-eNOS 5μg/ml。辐照48h后,采用RT-PCR、Western blot及免疫组化检测VSMC内eNOSmRNA和蛋白的表达。 结果RT-PCR检测质粒+超声辐照+造影剂组eNOSmRNA的表达最显著,IOD比值为(91.11±3.41)%,单纯质粒浸泡组、质粒+微泡造影剂组、质粒+超声辐照组也有少量表达,IOD比值分别为(26.10±1.32)%、(31.42±2.43)%、(35.05±2.25)%,与E组相比P0.05。蛋白印迹分析eNOS蛋白表达,空白对照组有极少量表达,单纯质粒浸泡组、质粒+微泡造影剂组也有少量表达,IOD比值分别为(22.12±1.33)%、(25.42±2.41)%、(33.11±3.11)%;而质粒+超声辐照+造影剂组表达最明显,IOD比值为(84.22±9.22)%,与各组相比P0.05。 结论超声辐照结合造影剂微泡能显著提高eNOS基因在VSMC的转染效率,提高细胞内一氧化氮合成酶的表达。 目的探讨微泡造影剂结合超声辐照介导基因转染移植静脉桥的可行性。 方法建立SD大鼠颈外静脉-颈总动脉移植模型,选择增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)为报告基因。将大鼠颈外静脉段浸泡入粘附质粒的微泡中,予超声照射,再将静脉段间置植入颈总动脉,2d后,取出静脉段行快速冰冻切片,荧光显微镜下观察血管平滑肌内荧光表达,同时进行苏木精-伊红染色行病理观察。 结果微泡造影剂结合超声辐照组的荧光强度显著高于质粒浸泡+超声辐照组、质粒+微泡造影剂组及单纯质粒浸泡组(P0.05)。苏木精-伊红染色观察血管组织并无坏死灶的出现。 结论微泡造影剂结合超声辐照可以实现基因靶向转染至大鼠移植静脉桥的血管平滑肌中。 目的探讨微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧气化氮合成酶基因转染防治移植静脉血管桥再狭窄的可行性。 方法重组真核表达载体pcDNA3.1-eNOS经微泡造影剂及超声辐照介导体外转染大鼠颈外静脉,再将静脉段间置植入颈总动脉,建立SD大鼠颈外静脉颈总动脉旁路移植模型。于术后四周,取移植静脉标本分别进行苏木精-伊红染色,免疫组织化学染色及Western blot分析,观察内皮一氧化氮合成酶基因在静脉桥中的功能表达和静脉桥新生内膜的增生情况。 结果微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧气化氮合成酶基因转染组的移植血管桥内一氧化氮合成酶基因在静脉桥中的功能表达明显强于模型对照组、单纯质粒浸泡组、质粒+微泡造影剂组及质粒浸泡+超声辐照组;内膜增生明显减弱,再狭窄程度显著低于其他各对照组。 结论微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧气化氮合成酶基因转染可以有效抑制移植静脉桥新生内膜的增生,为预防移植血管狭窄的基因治疗提供了新思路。


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