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TLR4受体及其信号通路在胰腺癌进展中的作用

张建军  
【摘要】: 目的研究Toll样受体4(TLR4)和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在胰腺癌中的表达及其临床意义。 方法采用实时荧光定量PCR检测30例新鲜胰腺癌及相应癌旁组织标本中TLR4和HIF-1αmRNA水平,应用免疫组化检测TLR4、NF-κB p65和HIF-1α在65例胰腺癌及相应38例癌旁组织中的表达,分析其与临床病理特征间的关系以及TLR4和HIF-1α表达的相关性。应用Kaplan-Meier生存分析研究TLR4、HIF-1α蛋白表达对患者生存时间的影响。 结果实时荧光定量PCR结果表明胰腺癌组织中的TLR4、HIF-1αmRNA水平分别为0.81±0.10、0.87±0.11,显著高于癌旁组织(0.70±0.16、0.68±0.13,p0.05);免疫组化结果显示TLR4、NF-κB p65和HIF-1α蛋白在胰腺癌组织中的表达率分别为69.20%、66.15%和70.80%,显著高于癌旁组织(39.50%、31.58%和36.8%,p0.05),TLR4和HIF-1α的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位及分化程度无关,而与肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯及临床TNM分期相关。TLR4和HIF-1α表达呈正相关。TLR4或HIF-1α阴性组患者的生存时间显著长于TLR4或HIF-1α阳性组。 结论TLR4、NF-κB p65和HIF-1α在胰腺癌中高表达,TLR4可能通过NF-κBp65途径参与了HIF-1α的表达调控,共同促进了胰腺癌的恶性进展。 目的构建针对人TLR4基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出对胰腺癌细胞系PANC-1基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体,转染胰腺癌细胞并筛选出稳定转染的克隆细胞株。 方法针对TLR4基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,测序鉴定,脂质体法转染至胰腺癌PANC-1细胞,48h后实时荧光定量PCR检测TLR4 mRNA被抑制情况。将抑制效率最高的shRNA质粒转染PANC-1细胞,G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法挑选培育稳定转染TLR4 shRNA的单克隆细胞系,实时定量PCR和流式细胞技术检测单克隆细胞系中TLR4 shRNA转染效率和基因沉默效率。 结果经测序证实,成功构建TLR4 shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞48h后,转染效率为46.72%±5.06%, TLR4 mRNA水平明显下调;其中以TLR4 RNAi-3#重组质粒的沉默效应最强(0.019±0.006 vs 0.061±0.018,P=0.000)。将TLR4 RNAi-3#转染至PANC-1细胞,G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法形成稳转单克隆细胞系,与转染48h比较,转染效率显著提高(82.79%±8.16% vs 46.72%±5.06%, P=0.001), TLR4 mRNA显著被抑制(0.010±0.002 vs 0.019±0.006,P=0.01),稳转细胞TLR4蛋白表达率显著低于PANC-1细胞或转染阴性质粒细胞(0.54%±0.32%vs 87.42%±5%;0.54%±0.32%vs 82.9%±5%,P=0.000)。 结论成功构建了携带以TLR4为靶向的shRNA的重组质粒,其对胰腺癌PANC-1细胞TLR4的表达具有显著抑制效应,TLR4 shRNA稳定转染细胞的转染效率以及基因沉默效率显著高于转染48h。该实验为进一步研究TLR4的功能提供了实验基础。 目的研究胰腺癌细胞系PANC-1中TLR4信号通路对HIF-1αmRNA和蛋白表达的影响及调控机制。 方法分别将PANC-1细胞、转染阴性对照质粒的PANC-1 RNAi Ctro细胞以及转染shRNA TLR4表达质粒的PANC-1 RNAi TLR4细胞用低氧模拟剂氯化钻(CoCl2,100μmol/L)、不同浓度的TLR4配体脂多糖(LPS, 0μg/ml, 1μg/ml,10μg/ml,)和NF-K B特异性抑制剂PDTC (25μM)进行不同时间(6h,12h,24h,48h)的干预,实时荧光定量PCR检测细胞中HIF-1αmRNA水平,免疫印迹检测HIF-1α蛋白表达情况。分别用LPS (1μg/ml, 10μg/ml)作用PANC-1细胞及PANC-1 RNAi TLR4细胞30min,电泳迁移率实验(EMSA)分析细胞中的NF-κB活性。 结果胰腺癌细胞中LPS以时间和剂量依赖的方式上调了HIF-1αmRNA及蛋白的表达。NF-κB抑制剂PDTC和TLR4基因沉默均显著抑制了LPS诱导的HIF-1α表达,LPS诱导了PANC-1细胞中NF-KB的活化。 结论TLR4信号通路通过NF-κB途径参与了HIF-1α的表达上调。 目的研究TLR4信号通路对胰腺癌细胞粘附和侵袭能力的影响极其机制 方法分别对PANC-1细胞、转染阴性对照质粒的PANC-1 RNAi Ctro细胞以及转染shRNA TLR4表达质粒的PANC-1 RNAi TLR4细胞用不同浓度的LPS和NF-κB特异性抑制剂PDTC进行不同时间的干预,粘附实验检测细胞和基质胶MaxGel的粘附率,Transwell小室侵袭实验检测干预后细胞的侵袭力,流式细胞技术检查癌细胞中整合素β1 (Integrinβ1)的表达,ELISA检测细胞培养上清夜中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的浓度,细胞免疫荧光实验观察LPS作用后PANC-1细胞中NF-κB核转位情况。 结果LPS以时间和剂量依赖的方式促进了PANC-1细胞与基质胶的粘附,并增强了细胞侵袭力。NF-κB抑制剂PDTC和TLR4基因沉默抑制了细胞的粘附率及侵袭力。LPS上调了PANC-1细胞中Integrinβ1蛋白的表达,促进细胞分泌MMP-9。NF-κB抑制剂PDTC抑制了LPS对PANC-1细胞Integrinβ1和MMP-9表达的诱导作用。LPS未能引起PANC-1 RNAi TLR4细胞中Integrinβ1和MMP-9表达上调。LPS促进了PANC-1细胞NF-κB p65核转位,但对PANC-1 RNAi TLR4细胞未见LPS对NF-κB p65核转位的诱导。 结论TLR4信号通路上调了胰腺癌细胞中整合素β1和基质金属蛋白酶-9的表达,从而促进了癌细胞与细胞外基质的粘附,增加了癌细胞的侵袭力。


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