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人肺腺癌细胞耐顺铂系A549/CDDP的比较蛋白组学研究

石思恩  
【摘要】: 背景:肺癌已经成为我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,大约70%的患者在诊断时已发展至晚期,无法通过手术治愈,化疗成为肺癌综合治疗中的重要部分,但是肿瘤细胞对化疗药物发生耐药常导致化疗失败。近年来,人们对肿瘤细胞的耐药机制进行了深入的研究。 一直以来,顺铂被认为是肺癌化疗的基石,含铂方案是晚期NSCLC化疗的标准方案,几乎所有一线NSCLC化疗方案都是与顺铂联合应用的方案。顺铂的作用机理是进入肺癌细胞后,与DNA交叉联结,形成稳定的顺铂-DNA复合物,阻断DNA复制,引起肺癌细胞死亡。近年来国内外研究表明,肺癌细胞对顺铂发生耐药的机制,除了早先认为的肿瘤细胞内药物浓度降低、药物在细胞内代谢降解外,更是与DNA损伤修复增强密切相关,是一个多基因参与的复杂事件,涉及了多种蛋白质与数条途径,如已发现由跨膜转运蛋白、多药耐药相关蛋白和肺耐药相关蛋白介导的典型耐药途径,和由其它非跨膜机制如凋亡、酶活性、细胞内pH等变化介导的非典型耐药途径。但肺癌耐药的机制至今仍未完全阐明。因此不断寻找新的耐药相关基因并进行深入研究,对阐明肺癌细胞的耐药机制,进而寻找逆转耐药的途径,具有重要意义。 目的:诱导人肺腺癌细胞A549对顺铂耐药,研究A549细胞产生耐药性前后的蛋白表达差异,明确这些差异蛋白与肺癌耐药的关系,以期为肺癌的治疗发现新的靶点,为揭示肺癌的耐药机制提供线索,并为寻找逆转耐药途径提供基础。 方法:以顺铂为诱导药物,人肺腺癌细胞系A549为诱导对象,采用逐步增加剂量与大剂量冲击相结合的方法,诱导建立耐顺铂细胞株A549/CDDP。对A549与A549/CDDP进行蛋白组学研究,即利用双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide electrophoresis,2D-PAGE)分离两组总蛋白后,通过图像分析寻找表达差异的蛋白点,对其进行MALDI-TOF质谱分析。对经质谱鉴定的蛋白质,通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默A549和A549/CDDP细胞内目标蛋白基因的表达,应用蛋白印迹法(western blot)和四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)探讨沉默该基因表达对肺癌细胞生物学行为的影响,阐明其功能。 结果:建立了稳定的耐顺铂细胞系A549/CDDP。比较A549和A549/CDDP两者的2D-PAGE图谱,得到差异蛋白点82个。对其中6个差异蛋白点进行肽质量指纹图分析,鉴定出葡萄糖调节蛋白75、核糖体蛋白S4、线粒体F1-ATP合酶p亚单位、免疫球蛋白重链可变区。以上差异蛋白均在耐药株中过表达,而在对照组细胞中低表达或不表达。A549和A549/CDDP细胞成功转染GRP75 siRNA,转染后A549/CDDP细胞GRP75蛋白明显下调,bcl-2蛋白下调,p53蛋白上调,转染后A549/CDDP细胞对顺铂敏感性有所增强。 结论:成功地通过逐步增加剂量与大剂量冲击相结合的诱导方法建立肺癌耐药株。运用蛋白组学技术鉴定的差异蛋白为阐明肺癌细胞对顺铂耐药性产生的机制提供线索,也为筛选具体潜在价值的肺癌化疗靶位提供理论依据。证实了GRP75高表达与肺癌细胞耐药性的产生相关,为克服肺癌化疗耐药提供了新的突破口。


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