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LOX-1介导ox-LDL导致eNOS去磷酸化的新机制:内质网应激的作用

熊宇芳  
【摘要】: 内皮功能紊乱是动脉粥样硬化(AS)发生过程中最早和最有决定性的事件之一。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)通过降低eNOS的活性,NO产生减少从而导致内皮功能紊乱是不争的事实。凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)是内皮细胞膜上特异性识别摄取ox-LDL的最主要受体,LOX-1在介导ox-LDL导致内皮功能紊乱的过程中起关键作用。蛋白激酶Akt磷酸化eNOS的丝氨酸1179/1177(牛/人)位点是调控eNOS活性的关键因素。最新研究显示:ox-LDL可促发内皮细胞的内质网应激反应(ER stress),从而引起内皮功能紊乱。然而,ox-LDL导致eNOS活性下降的具体分子机制仍不十分清楚,是否与ox-LDL促发内质网应激反应有关,仍有待进一步研究。 因此,在本研究中我们采用ox-LDL(200μg/ml)孵育人脐静脉内皮细胞(HUVEC), Western blotting检测内质网应激标志物PERK(PRK-like endoplasmic reticulum kinase)的磷酸化程度逐渐上升,特别是ox-LDL孵育半小时后。p-PERK的磷酸化程度和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的蛋白表达水平,以此来评估内质网应激反应的发生。研究发现,ox-LDL孵育HUVEC0.5小时即可诱发内质网应激反应(P0.01,n=3)。进一步评估eNOS的磷酸化程度发现,ox-LDL可致eNOS的Ser1177位点的磷酸化程度显著降低,并呈时间依赖性,而eNOS的Thr 497位点的磷酸化程度以及eNOS的蛋白表达水平均无改变。这一结果提示:ox-LDL导致的eNOS的Ser1177位点的去磷酸化具有显著位点特异性。同时,我们也检测了eNOS的酶活性,结果显示,和对照组相比,ox-LDL可显著降低eNOS的酶活性(P0.05,n=3),且呈时间依赖性,该结果与ox-LDL导致的eNOS的Ser1177位点的去磷酸化程度一致。同时我们发现:ox-LDL处理组的Akt的Thr308和Ser473位点的磷酸化程度也显著下降,该结果提示:Akt的活性显著降低。而细胞总蛋白抽提物中蛋白磷酸酶PP2A和PP1的表达均无改变。我们进一步采用Pull-down技术证明,在ox-LDL短期孵育的HUVEC中,Akt失活导致eNOS Ser1177位点去磷酸化与PP2A和PP1与eNOS的相互作用程度无关。 我们进一步采用化学伴侣分子PBA(可降低ER stress)预处理HUVEC14小时,再用ox-LDL孵育0-4小时。结果显示,PBA处理组可显著降低ox-LDL诱导的p-PERK和GRP78的表达(P0.01),即PBA降低了HUVEC的内质网应激反应。同时,PBA可显著逆转ox-LDL导致的eNOS Ser1177位点和Akt Thr308、Akt Ser473位点的去磷酸化程度。为进一步证明内质网应激在ox-LDL导致的eNOS活性下降中起关键作用,我们采用内质网应激诱导剂BFA(5μg/ml)处理HUVEC,结果发现:Akt和eNOS的磷酸化程度显著下降,且呈时间依赖性。这一结果证明:内质网应激可导致Akt和eNOS Ser1177位点的去磷酸化。 我们进一步探讨内质网应激反应是否通过PI3K/Akt信号通路下调eNOS的磷酸化程度,我们采用PI3K抑制剂LY294002(0.5nM)和PI3K激活剂IGF-1(100ng/ml)分别处理HUVEC,结果显示:内质网应激诱导剂BFA可直接影响PI3K/Akt信号通路,进而导致eNOS Ser1177位点的去磷酸化。 我们也检测了是否是LOX-1介导ox-LDL促发内质网应激反应。我们采用LOX-1封闭抗体JTX20处理细胞,结果发现:JTX20预处理HUVEC可显著逆转ox-LDL导致的eNOS和Akt的去磷酸化。我们进一步评估HUVEC内质网应激反应的程度,发现JTX20也逆转了细胞内p-PERK和GRP78的表达(P0.01),即JTX20可降低HUVEC的内质网应激反应。 上述结果提示:ox-LDL经LOX-1介导可促发内质网应激反应,并通过Akt信号途径下调eNOS的磷酸化程度,从而导致eNOS的功能下降。


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