骨桥蛋白shRNA表达载体介导RNA干扰抑制前列腺癌PC-3细胞生长和侵袭

【摘要】： 研究背景和目的：骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)是一种分泌型钙结合的磷酸化糖蛋白。在多种高转移性的恶性肿瘤细胞和患者的血清中均有OPN的过度表达。OPN诱导肿瘤细胞的浸润和转移与基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活化密切相关,OPN通过IKK (I kappa B kinase)酶依赖的信号通道诱导NF-κB (nuclear factor kappaB)介导的MMP-2和MMP-9的活化。本研究旨在探讨OPN在人前列腺癌PC-3细胞的增殖和侵袭过程中所发挥的作用,为IKK-1和IKK-2酶在NF-κB介导的信号通道中可能的功能提供实验依据。方法：构建四种含OPNshRNA的真核表达载体,分别转染人前列腺癌PC-3细胞,然后采用半定量RT-PCR方法筛选能显著抑制OPN基因表达的重组质粒。建立稳定转染OPNshRNA重组质粒的PC-3细胞株,并且应用不同浓度的IKK抑制剂Ⅶ分别抑制IKK-1和IKK-2两种酶的活性,然后采用Real-time PCR和Western blot分别检测OPN、MMP-2和MMP-9三种mRNA和蛋白的表达水平,ELISA法检测加入OPN蛋白培养的PC-3细胞的条件培养基中MMP-2、MMP-9的浓度。流式细胞术、MTT法和Transwell实验分别检测细胞生长周期变化、细胞增殖和和侵袭能力变化。应用成瘤实验观察OPN shRNA表达载体对PC-3细胞在裸鼠体内的生长潜能的影响。结果：RT-PCR方法成功筛选出能显著抑制前列腺癌PC-3细胞中OPN表达的OPN shRNA重组质粒PGPU6/GFP/Neo-OPN2,建立了稳定传代的细胞株PCs, PC/Vect和PC/OPN2。与PCs组相比,转染重组质粒的细胞PC/OPN2中OPN、MMP-2和MMP-9三种蛋白的表达量分别下降了55.22%、51.71%和28.35%(P0.05),PC/OPN2细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到明显抑制。此外,特异性地抑制IKK-2酶的活性能显著降低MMP-2和MMP-9的表达水平,而抑制IKK-1酶的活性对MMP-2和MMP-9的表达水平没有明显影响。结论：OPN shRNA表达载体介导的OPN基因沉默不仅能下调OPN的表达而且能抑制MMP-2和MMP-9的分泌,OPN shRNA对前列腺癌PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用,而且该过程与MMP-2和MMP-9两种酶的表达减少密切相关,此外,在NF-κB介导的OPN诱导MMP-2和MMP-9活化的过程中IKK-2酶的活性发挥了重要的作用。