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长链Omega-3多不饱和脂肪酸对重症急性胰腺炎的调节作用及其机制的实验研究

程锐  
【摘要】: 临床上急性胰腺炎分为急性水肿性胰腺炎和急性出血坏死型胰腺炎两种类型。前者为轻型,临床症状轻,预后良好;而后者为重型急性胰腺炎,病变以广泛的胰腺坏死、出血为特征,可累及胰腺周边组织,并能导致全身炎症反应的失控,损伤重要脏器功能,最终造成多器官功能衰竭。重症急性胰腺炎病情凶险,死亡率高,是较为棘手的临床难题。随着近年来对重症急性胰腺炎研究的深入,临床医生及科研工作者对对于该病的病理生理、发生发展及诊断治疗都有了一定的认识。SAP的临床病程分为三期:急性反应期、全身感染期和残余感染期。其中,急性反应期出现的过度的炎症反应所导致的全身炎症反应综合症及其进一步发展造成的多器官功能障碍综合征是主要的死亡原因。控制早期过度的炎症反应,维持炎症反应平衡是治疗SAP的关键。 ω-3多不饱和脂肪酸炎症调控作用的发现为重症急性胰腺炎的抗炎治疗提供了新的思路。目前已有研究对ω-3多不饱和脂肪酸在急性胰腺炎中的作用进行了探索,初步明确了ω-3 PUFAs抗炎作用在重症急性胰腺条件下同样存在。然而,这些研究多为描述性研究,并未对ω-3 PUFAs在SAP中抗炎作用的机理进行探讨,使得ω-3 PUFAs进一步的临床应用缺乏实验基础和指导。 本研究旨在通过体内外不同水平的研究,进一步探讨ω-3 PUFAs在SAP中抗炎作用,明确其作用的机制,为后续的临床研究及应用提供实验依据,使得ω-3 PUFAs在抗炎作用能更好的用于重症急性胰腺炎的治疗。实验包括以下三部分内容: 第一部分:ω-3 PUFAs在大鼠重症急性胰腺炎模型中的作用及其机制的实验研究; 第二部分:ω-3 PUFAs在体外胰腺腺泡细胞培养体系中的炎症调控作用及机制; 第三部分:解偶联蛋白-2基因表达对重症急性胰腺炎炎症调控作用的实验研究。 目的:在大鼠重症胰腺炎动物模型中,探讨ω-3 PUFAs的抗炎作用及其潜在的机制。 方法:将60只SD大鼠随机分为三组:实验组(EG)、空白对照组(BCG)、阴性对照组(NCG)。实验组和阴性对照组采用胰胆管低压逆行注射甘氨脱氧胆酸(GDOC)结合静脉持续给予雨蛙肽的方法建立大鼠重症急性胰腺炎模型;空白对照组大鼠仅行开腹手术。建模六个小时后,EG动物由静脉通道给予由生理盐水及ω-3PUFAs脂肪乳组成的混合液;NCG组给予普通生理盐水。持续输入24小时后,处死大鼠,留取外周血、胰腺及肺组织标本。检测血清中ALT、AST、amylase、IL-6、IL-10、TNF-α水平;组织切片HE染色行病理检查;流式细胞术检测外周血中CD4+T细胞和CD+8T细胞的比值;实时定量PCR检测外周血单个核细胞中Foxp3、IL-2mRNA表达及胰腺组织中UCP-2 mRNA的表达;Western blot检测UCP-2在胰腺组织中的蛋白表达;免疫组织化学技术检测NF-KB的核转位。 结果:建立胰腺炎模型组(EG和NCG)血清中所测的指标均高于空白对照组(BCG)。EG大鼠IL-10浓度高于NCG,而IL-6、TNF-α浓度低于NCG;ALT、ALT、amylase在EG和NCG动物血清中的表达没有明显的差异;实验组外周血中CD4+/CD8+T细胞比值、Foxp3和IL-2 mRNA表达低于NCG;胰腺组织中UCP-2基因的mRNA和蛋白表达也低于NCG。此外,NCG中的NF-KB表现出更多的活化。 结论:ω-3 PUFAs能下调大鼠重症急性胰腺炎模型中的炎症反应,其机制可能包括影响T细胞功能、抑制NF-KB活化和下调UCP-2基因的表达。 目的:探讨体外胰腺腺泡细胞培养体系中ω-3 PUFAs对炎症的调控作用及机制。 方法:MTT法确定雨蛙肽的最佳刺激浓度后,将体外培养的胰腺腺泡细胞系AR42J分为A、B、C三组:A组不做特殊处理;B组细胞用50μmol/的DHA预处理后加10-8mol/L的雨蛙肽刺激;C组用10-8mol/L的雨蛙肽刺激。实时荧光定量PCR检测细胞中TNF-α、IL-6和UCP-2 mRNA的表达;Western blot检测细胞核中NF-KBp65亚单位的含量;Hoechest33342/PI原位染色荧光显微镜观察细胞坏死及凋亡情况。 结果:使用与雨蛙肽刺激的实验组细胞(B组和c组)中TNF-α、IL-6和UCP-2mRNA的表达较A组均明显增加,而B组的表达水平低于C组(P0.05);B组细胞中UCP-2基因的蛋白表达及细胞核中的NF-KBp65亚单位的含量也低于C组;荧光显微镜观察可见C组较B存在更多的细胞坏死。 结论:在体外细胞培养体系中,ω-3 PUFAs能够抑制雨蛙肽刺激下胰腺腺泡细胞炎症因子的转录,下调UCP-2基因的表达,并减少NF-KB的核转位。 目的:研究UCP-2基因表达对炎症状态下胰腺腺泡细胞死亡方式的影响,探讨其作为胰腺炎严重程度重要调控点的可能性。 方法:针对UCP-2 mRNA设计3个RNA干扰靶点序列,构建并鉴定靶向UCP-2基因的RNA干扰慢病毒载体,筛选出其中最优的干扰序列用于实验。胰腺腺泡细胞系AR42J分为三组:实验组细胞采用RNA干扰慢病毒载体感染,实现对UCP-2基因的特异性敲减;阴性对照组使用空载体转染;空白对照组不做转染。荧光显微镜镜检确定感染效率,实时聚合酶链反应鉴定敲减效果。以10-8mol/L的雨蛙肽刺激细胞,采用Annexin V/PI双标流式细胞仪检测刺激后不同时间点细胞的坏死率和凋亡率;收集细胞检测细胞内ATP、ROS水平。 结果:PCR和测序结果显示针对三个靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过与UCP-2表达质粒共转染293细胞及Western blot险测获得最优干扰靶点,并成功包装成滴度为5×108TU/ml的慢病毒。实验组细胞UCP-2基因被有效的敲减,细胞内对应时间点的细胞内ROS、ATP的水平以及细胞凋亡率均显著高于阴性对照组细胞,坏死率则显著低于阴性对照组。 结论:抑制UCP-2基因表达能影响炎症状态下胰腺腺泡细胞死亡方式,使细胞坏死增多而凋亡减少。


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