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Ku70基因缺陷加速血小板衍生生长因子-C诱导的小鼠肝细胞肝癌的发生

张玮  
【摘要】: [目的]建立新的模拟人肝细胞肝癌发病过程的小鼠肝细胞肝癌发病合并染色体遗传不稳定性的实验动物模型。 [方法]使雄性PDGF-C+/-, Ku70+/-杂合子C57BL/6小鼠与雌性PDGF-C-/-,Ku70+/-杂合子小鼠交配,采用PCR基因鉴定法,对获得的新生小鼠进行基因型的鉴定。 [结果]上述两种小鼠交配后,产下的新生小鼠经过基因鉴定证实,包括PDGF-C+/-, Ku70+/+; PDGF-C+/-, Ku70+/-; PDGF-C+/-, Ku70-/-; PDGF-C-/-, Ku70+/+; PDGF-C-/-, Ku70+/-和PDGF-C-/-, Ku70-/-六种。其中有我们预期得到的基因型小鼠,即PDGF-C+/-,Ku70-/-型。成功建立了模拟人肝细胞肝癌发生发展的PDGF-C转基因合并染色体遗传不稳定性的小鼠实验模型。 [结论]PDGF-C+/-,Ku70-/-型小鼠具有两大特征:第一,PDGF-C基因过度表达而产生小鼠肝脏纤维化,脂肪肝,最终导致肝癌。第二,因Ku70基因缺陷而导致DNA损伤修复缺陷,产生染色体的遗传不稳定性。该肝细胞肝癌小鼠实验模型完全摆脱了化学致癌剂的接触,不需要化学制剂驱动,在PDGF-C的过度表达下就可以直接产生肝癌,并且具备了染色体的不稳定性。该模型是目前世界上独一无二的。 [目的]探讨Ku70基因缺陷是否能加速血小板衍生生长因子-C诱导的小鼠肝细胞肝癌的发生。 [方法]将新生雄性小鼠按照基因型分为四组:野生型组;PDGF-C转基因组;Ku70基因缺失组和PDGF-C Tg/Ku70 KO组。于6个月龄时,收集小鼠肝脏,称重。肝脏组织常规切片(5μm),行H E染色后显微镜下观察。对肝脏内的病变进行评估。 [结果]与其他三组相比,实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠肝脏出现明显的大体形态学改变,肝脏体积偏大,形态失常,不规则,肝脏表面出现黄色物质沉积,质地尚软,边缘不光整,有些肝脏还出现大小不一的囊肿或是异常的新生肿块。显微镜下组织形态学检测发现局部肝脏出现病变。病变的肝组织出现以下各种改变:不典型增生结节、不典型增生微灶、脂肪变性、小细胞改变和大量的肝脏非实质细胞增生。肝细胞的异常表现在细胞核大小不均,着色过深,多形性细胞核和细胞的核浆比增大。实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠与其他三组小鼠相比,肿瘤的发生率(100%)显著增高(P0.05),不典型增生微灶数目显著增多,每平方厘米肝组织中微灶的数目5.26±3.83个,同时微灶累及的肝组织的面积高达16.66±9.24%,与PDGF-C转基因小鼠相比数目和受累面积都明显增大(P0.05)。与野生型小鼠相比,实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠的肿瘤负荷显著增高(P0.05),但并不与PDGF-C转基因小鼠的肿瘤负荷形成显著性差异(P0.05)。 [结论]实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠(1)肝癌早期病变发生率显著增高(2)肝癌微灶和不典型增生结节数目明显增多(3)肝脏每平方米微灶的个数显著增多(4)受累肝脏组织的面积明显增大。Ku70基因缺失加速了PDGF-C诱导的小鼠肝细胞肝癌的发生。 [目的]探讨Ku70基因缺陷加速血小板衍生生长因子-C诱导的小鼠肝细胞肝癌发生的分子学机制。 [方法]将新生雄性小鼠按照基因型分为四组:野生型组;PDGF-C转基因组;Ku70基因缺失组和PDGF-C Tg/Ku70 KO组。于6个月龄时,收集小鼠肝脏,肝脏组织常规切片(5μm),采用免疫组织化学染色法及苦味酸-天狼星红染色法,对肝脏内的细胞增殖和凋亡,肝脏纤维化程度,肝脏脂肪变性程度和肝脏内炎症反应程度进行分析和评估。 [结果]得到如下结果: 1.与WT相比,PDGF-C转基因和实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠肝脏内BrdU阳性的肝细胞数显著增多(P<0.05)。PDGF-C转基因小鼠肝脏内BrdU阳性的肝细胞数比Ku70 KO小鼠显著增多(P0.05)。而肝脏非实质细胞的阳性数在PDGF-C转基因小鼠肝脏内显著多于WT和Ku70 KO小鼠(P0.05)。与PDGF-C转基因小鼠相比,PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠肝脏内BrdU阳性的肝细胞和非实质细胞均无显著差异。 2.与WT组相比,PDGF-C转基因小鼠和实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠肝脏肝细胞的Ki67标记阳性数都显著升高(*P0.05),Ku70 KO小鼠与其无明显差异。实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠与PDGF-C转基因小鼠相比,显示出较多的Ki67标记的阳性肝细胞(#P0.05)。两者与Ku70 KO小鼠相比,都显示出较多的Ki67标记的阳性肝细胞(§P0.05)。对肝脏不典型增生结节和/或不典型增生微灶的分析发现,不典型增生结节和/或不典型增生微灶内的Ki67阳性肝细胞及肝脏非实质细胞均显著多于周围正常的肝组织(*P0.05)。 3.正常野生型和Ku70 KO小鼠肝内无明显胶原着色。PDGF-C转基因小鼠和实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠肝内胶原沉积显著多于正常野生型和Ku70 KO小鼠(*P0.01)。实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠肝内胶原沉积明显,甚至出现桥接纤维化和肝硬化表现,但是其整体纤维化的程度并不比PDGF-C转基因高(P>0.05)。 4.肝脏内出现的炎症改变在四种不同基因型小鼠内有所不同。正常野生型小鼠和Ku70 KO小鼠肝内未见明显炎症细胞增生灶。PDGF-C转基因小鼠肝内炎症较重,与WT和Ku70 KO小鼠组相比,炎症程度有显著性增高(P0.01)。实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO与PDGF-C转基因小鼠组相比,炎症反应程度未见明显差异。 5.脂肪变性的严重程度在以上四组小鼠肝内相似,并无明显差异。 6.所有正常野生型小鼠肝脏内可见的凋亡小题数目极少,归类为0级。Ku70 KO小鼠组仅有一只小鼠肝脏内可见较多的凋亡小体,属于1级,其余四只均未见明显凋亡小体出现。与前两组相比,有2只PDGF-C转基因小鼠肝脏中出现较多凋亡小体,5只小鼠肝脏的凋亡小体检出数目归为0级。实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠肝脏有3/7被检出较多的凋亡小体,4/7的小鼠肝脏内凋亡小体并不多见。尽管在部分PDGF-C转基因组和实验组PDGF-C Tg/Ku70 KO小鼠的肝脏内有大量的凋亡小体被检出,但是这种差异在各组之间均无显著性。 [结论]Ku70基因缺失诱导的PDGF-C转基因小鼠肝细胞肝癌发生加速并不改变PDGF-C诱导的肝脏脂肪变性程度、纤维化严重程度、肝脏炎症反应程度,在与PDGF-C转基因小鼠相似的肝细胞肝癌发生背景下,通过促进DNA损伤修复不良的肝细胞增殖形成肝脏不典型增生结节和/或不典型增生微灶,并可能通过激活细胞周期G2/M检查点,让增殖的异常肝细胞停滞在G2/M期,却不诱导受损肝细胞凋亡来实现的。细胞周期停滞在G2/M期,是细胞受到DNA损伤之后的保护机制,但是细胞缺乏修复能力,同时并不诱导受损肝细胞凋亡,就使得受到损伤且不能被修复的DNA有可能将遗传信息传递到下一代,导致肿瘤的发生。


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