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线粒体DNA 4834 bp缺失突变在老年性聋发病中作用及其机制的研究

彭炜  
【摘要】: 第一部分D-半乳糖诱导的大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变率与听力随时间变化的相互关系及其机制研究 目的研究线粒体DNA 4834 bp缺失突变率与老年性聋的关系以及可能存在的导致老年性聋的阈值水平及相关机制。 方法实时定量PCR技术用于检测不同剂量D-半乳糖大鼠模型在各年龄阶段的线粒体DNA 4834 bp缺失突变率。听性脑干反应(ABR)检测大鼠听阈,比色法检测大鼠膜迷路过氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)浓度。 结果线粒体DNA 4834 bp缺失突变率随年龄增大而增加。同时,线粒体DNA4834 bp缺失突变率存在D-半乳糖剂量依赖效应。更重要的是,ABR阈值在高剂量D-半乳糖组中6个月后显著提高。 结论当线粒体DNA 4834 bp缺失突变率达到某个阈值时,ABR阈值可能会显著提高。氧化应激是引起线粒体DNA 4834 bp缺失突变的原因之一,但不排除其他因素参与线粒体DNA 4834 bp缺失突变的可能性。 第二部分不同程度饮食限制对D-半乳糖诱导的老年性聋的影响 目的长期注射D-半乳糖可以有效建立拟老化伴线粒体DNA 4834 bp缺失突变的动物模型。目前为止没有关于饮食限制对此模型大鼠的作用及其机制的研究。本文目的是阐明饮食限制对D-半乳糖诱导的内耳组织线粒体DNA 4834 bp高缺失突变率的拟老化大鼠是否有效并探索其机制。 方法1月龄雌性Wistar大鼠120只,随机分为5组:A组(24只,D-半乳糖+自由饮食),B组(24只,D-半乳糖+70%饮食),C组(24只,D-半乳糖+50%饮食),D组(24只,D-半乳糖+35%饮食),E组(24只,生理盐水+自由饮食)。D-半乳糖注射8周,随后持续1年饮食限制。听性脑干反应(ABR)检测大鼠听阈,比色法检测大鼠膜迷路过氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)浓度。实时定量PCR技术检测内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变率和线粒体DNA含量。实时定量RT-PCR技术检测TFAM, NRF-1, PGC-1α在mRNA的水平变化。Western blot检测NRF-1, PGC-1α蛋白水平的变化。 结果注射D-半乳糖6个月后ABR阈值显著提高。D-半乳糖组大鼠氧化损伤比对照组高,但是70%和50%饮食限制可减轻其损伤。D-半乳糖组大鼠线粒体DNA含量和线粒体DNA 4834 bp缺失突变率显著提高,但是被70%和50%饮食限制部分抑制。35%饮食限制组产生最多的活性氧族,最高的线粒体DNA 4834 bp缺失突变率和最低的SOD活性。PGC-1α(mRNA和蛋白水平)和TFAM (mRNA水平)的变化与线粒体DNA含量的变化一致。 结论D-半乳糖拟老化伴线粒体DNA 4834 bp缺失突变大鼠模型内耳组织中线粒体DNA生物学活性的变化与自然衰老大鼠内耳组织相关指标变化相似。70%和50%饮食限制能部分抑制D-半乳糖大鼠模型中衰老相关分子生物学和生理学变化。同时,35%饮食限制出现多种营养不良的表现。 第三部分α-硫辛酸对大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的预防作用及其机制 目的研究α-硫辛酸对大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的保护作用及其机制。 方法1月龄雌性Wistar大鼠40只,随机分为4组:A组10只(D-半乳糖组),5%D-半乳糖颈部皮下注射(150mg/kg/d),半小时后生理盐水腹腔注射,共8周。B组10只(D-半乳糖+硫辛酸组),D-半乳糖颈部皮下注射,半小时后100mg/Kg/dα-硫辛酸腹腔注射。C组10只(硫辛酸组),生理盐水颈部皮下注射,半小时后α-硫辛酸腹腔注射。D组10只(对照组),全部给予生理盐水。听性脑干反应(ABR)检测4组大鼠听阈,比色法检测4组大鼠膜迷路过氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)浓度。实时定量PCR技术检测内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变率。 结果四组之间ABR阈移差异无统计学意义(p0.05)。A组大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变率为12.53±1.70%,B组为6.17±1.04%,C组为4.89±0.78%,D组为5.244±0.75%。A组比其他组线粒体DNA 4834 bp缺失突变率高(p0.05),B组、C组与D组之间差异无统计学意义(p0.05)。A组SOD活性(36.16±5.53)比B组(75.15±10.56),C组(82.51±9.36),D组(81.68±5.19)SOD活性低(p0.05),而B组、C组与D组之间差异无统计学意义(p0.05)。A组MDA浓度(6.79±2.08)比B组(1.97±0.31),C组(1.67±0.25),D组(1.71±0.23)MDA浓度高(p0.05),而B组、C组与D组之间差异无统计学意义(p0.05)。 结论内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变率在12.5%以下时,不会引起明显听力损伤。a-硫辛酸可有效阻止活性氧族引起的大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的发生。


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