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硫酸卡那霉素慢性致聋豚鼠耳蜗细胞变性及蜗神经背核神经元和突触可塑性的时序性和机制研究

殷泽登  
【摘要】: 第一部分硫酸卡那霉素慢性致聋豚鼠听神经和螺旋神经节细胞变性的时序性及机制研究 目的:建立硫酸卡那霉素慢性致聋豚鼠模型。探讨硫酸卡那霉素慢性致聋豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞和听神经施万细胞变性的时序性及机制。比较急慢性致聋模型的差异。方法:耳廓反射正常,听力正常的成年白色红目豚鼠为研究对象,大腿内侧皮下每天注射硫酸卡那霉素500mg/kg,连续注射7天。注药后第1天、7天、14天、28天、56天、70天和140天定量分析耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞、听神经施万细胞和耳蜗内前庭神经节段听神经横切面积变化情况。结果:1、听功能:正常成年豚鼠的ABR阈值为35.83±5.97dBSPL,注药后1、7、14、28、56、70和140天的ABR阈值分别为48.13±3.45、83.44±7.47、105.00±8.37、104.38±5.44、108.75±7.64、104.38±9.17和107.19±12.24 dBSPL(各实验组与对照组比较,P0.001)。2、耳蜗中轴内外毛细胞计数:与正常对照组比较,注药后1、7、14、28、56、70和140天耳蜗中轴7个部位外毛细胞残留率分别为98.56±1.26%、27.56±2.94%、20.81±2.76%、19.19±3.15%、19.25±2.24%、19.56±3.35%和18.60±2.73%(除1天组外,其余实验组与正常对照组比较,P0.001),底回外毛细胞残留率分别为98.48±1.28%、24.99±2.52%、16.60±3.07%、11.94±1.34%、10.96±2.44%、11.05±2.32%和11.20±1.23%(除1天组外,其余实验组与正常对照组比较,P0.001);耳蜗中轴7个部位内毛细胞残留率分别为99.00±0.97%、97.63±1.20%、67.56±4.60%、59.19±5.05%、56.81±3.97%、56.87±3.69%和57.20±3.45%(除1天和7天组外,其余实验组与正常对照组比较,P0.001),底回内毛细胞残留率分别为98.82±1.08%、96.92±1.03%、57.92±4.05%、38.21±3.45%、37.77±3.13%、36.34±3.19%和37.08±3.14%(除1天和7天组外,其余实验组与正常对照组比较,P0.001)。3、螺旋神经节细胞计数:正常组及注药后1、7、14、28、56、70和140天耳蜗7个部位螺旋神经节细胞数量分别为4105.17±82.96、4008.00±94.19、3130.69±127.67、2858.38±153.48、2633.00±151.95、2618.06±129.76、2624.38±142.59和2625.63±137.69(除1天组外,其余实验组与正常对照组比较,P0.001);正常组及注药后1、7、14、28、56、70和140天耳蜗底回螺旋神经节细胞数量分别为2091.00±86.62、2073.13±95.40、1576.94±96.77、1194.00±97.81、859.31±64.92、849.94±64.37、852.50±52.08和840.19±53.55(除1天组外,其余实验组与正常对照组比较,P0.001)。4、听神经横切面施万细胞计数:正常组及注药后1、7、14、28、56、70和140天前庭神经节段听神经横切面施万细胞数量分别为6167.17±80.81、6082.88±121.00、3946.00±128.67、3004.31±167.45、2742.44±90.61、2747.63±98.69、2730.38±78.08和2782.69±78.70(除1天组外,其余实验组与正常对照组比较,P0.001)。5、前庭神经节段听神经横切面面积测量:正常组及注药后1、7、14、28、56、70和140天前庭神经节段听神经横切面面积分别为0.15±0.020、0.17±0.004、0.12±0.007、0.13±0.007、0.13±0.007、0.11±0.012、0.12±0.008和0.13±0.013mm2(各实验组与正常对照组比较,P0.001)。结论:1、硫酸卡那霉素对听功能、耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞、听神经施万细胞的影响是逐渐累积的。2、螺旋神经节细胞和施万细胞的早期变性可能是硫酸卡那霉素直接毒性作用所致,螺旋神经节细胞后期的变性可能与毛细胞和施万细胞的丢失、硫酸卡那霉素的累积效应等多重因素有关。3、硫酸卡那霉素急慢性致聋模型细胞变性时序性有差异。 第二部分硫酸卡那霉素慢性致聋豚鼠蜗神经背核神经元和突触可塑性的时序性及机制研究 目的:探讨硫酸卡那霉素慢性致聋豚鼠蜗神经背核(DCN)梭形细胞和听神经-梭形细胞(AN/FC)突触可塑性变化的时序性和机制。方法:耳廓反射正常,听力正常的成年白色红目豚鼠为研究对象,大腿内侧皮下每天注射硫酸卡那霉素500mg/kg,连续注射7天。注药后第1天、7天、14天、28天、56天、70天和140天研究成年豚鼠DCN梭形细胞和听神经-梭形细胞突触超微结构变化;同时应用实时荧光定量PCR技术定量分析DCN局部胰岛素样生长因子1(IGF-1)mRNA表达变化情况。结果:1、听功能:正常成年豚鼠的ABR阈值为36.00±4.76dBSPL,注药后1、7、14、28、56、70和140天的ABR阈值分别为46.46±3.45、80.63±5.95、103.95±6.59、106.25±5.16、108.33±8.81、106.67±9.17和106.88±7.91dBSPL(各实验组与正常对照组比较,P0.001)。、2、IGF-1 mRNA扩增倍数:正常组及注药后1、7、14、28、56、70和140天DCN局部IGF-1 mRNA扩增倍数分别为1、0.88±0.17、1.53±0.21、2.07±0.17、1.51±0.23、1.92±0.14、1.87±0.15和0.97±0.11(除第140天组外,其余实验组与正常对照组比较,P0.001)。3、DCN梭形细胞和AN/FC突触超微结构:从注药后第7天到56天梭形细胞的线粒体和内质网的肿胀逐渐加重、溶酶体逐渐增多、核膜皱缩;AN/FC突触线粒体肿胀也逐渐加重,神经元和突触线粒体有空泡形成;注药后70天和140天神经元和突触超微结构逐渐恢复正常。4、AN/FC突触突触后密度(PSD)厚度测量:正常组及注药后1、7、14、28、56、70和140天PSD厚度分别为47.91±4.56、72.54±1.98、67.56±1.58、66.49±2.24、47.78±2.16、47.80±3.35、49.42±1.60、47.32±4.45和49.48±2.47 nm(与正常对照组比较,1、7和14天组,P0.001;28、56、70和140天组,P0.05)。结论:1、硫酸卡那霉素可能对DCN梭形细胞和突触有直接毒性作用,对梭形细胞和AN/FC突触的超微结构的影响是逐渐累积的。2、对硫酸卡那霉素导致的直接损伤和进行性不完全去传入,DCN的神经元和突触具有可塑性,神经元和突触的超微结构可以恢复正常。3、DCN局部的IGF-1可能通过抑制神经元凋亡和促进突触的重排参与了神经元和突触重塑过程。 第三部分兴奋性和抑制性递质受体在硫酸卡那霉素慢性致聋豚鼠蜗神经背核突触重塑中作用研究 目的:探讨兴奋性和抑制性递质受体在硫酸卡那霉素慢性致聋豚鼠蜗神经背核突触重塑中的作用。方法:耳廓反射正常,听力正常的成年白色红目豚鼠为研究对象,大腿内侧皮下每天注射硫酸卡那霉素500mg/kg,连续注射7天。注药后第1天、7天、14天、28天、56天、70天和140天,采用免疫组化技术研究成年豚鼠蜗神经背核突触素表达变化的情况,同时应用实时荧光定量PCR技术定量分析蜗神经背核N-甲基-D-天冬氨酸型受体1(NR1)和γ-氨基丁酸型受体A型α1亚单位(GABRA1)mRNA表达变化情况。结果:1、蜗神经背核突触素的表达有两种形式。一种斑点状均匀分布在神经纤维网上,另一种分布在细胞体周围。在蜗神经背核,第二种形式的分布较常见。2、除70天和140天组外,其余实验组的突触输入数量均有不同程度的增加(与对照组比较,P0.05)。突触素平均灰度(突触素表达量),1天、7天、28天、56天实验组表达增加(与对照组比较,P0.001)。突触素免疫染色面积(突触末端占据的面积),只有7天14天组有显著的下降(与对照组比较,P≤0.01)。3、正常组及注药后1、7、14、28、56、70和140天蜗神经背核内NR1 mRNA扩增倍数分别为1、1.58±0.18、2.20±0.33、3.67±0.34、2.04±0.30、1.34±0.36、1.28±0.21和1.29±0.17。与对照组比较,第1、7、14和28天,NR1 mRNA表达上调(P0.001)。4、正常组及注药后1、7、14、28、56、70和140天蜗神经背核内GABRA1 mRNA扩增倍数分别为1、0.77±0.08、0.45±0.09、0.34±0.07、0.32±0.07、0.90±0.11、0.94±0.12和0.92±0.11,与对照组比较,第1、7、14和28天,GABRA1 mRNA表达下调(P0.001)。结论:1、硫酸卡那霉素对蜗神经背核内突触数量以及兴奋性和抑制性递质受体的分布的影响是逐渐累积的。2、硫酸卡那霉素慢性致聋后,蜗神经背核内兴奋性和抑制性递质受体出现重排。3、在硫酸卡那霉素所致进行性不完全去传入和神经元损伤后,兴奋性谷氨酸能突触通路的活性增强,抑制性GABA能突触通路活性减弱。4、兴奋性和抑制性递质受体重排可能在硫酸卡那霉素慢性致聋后突触重塑中发挥了重要作用。


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