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两种核素报告基因系统用于监测治疗基因VEGF165表达的基础研究

张国鹏  
【摘要】: 目的:将人血管内皮生长因子165(human vascular endothelial growth factor 165, hVEGF165)基因分别与报告基因GGC肽(diglycylcysteine,双甘氨酰半胱氨酸)基因序列及突变型单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因(mutant herpes simplex virus type 1 thymidine kinase, HSV1-sr39tk)通过基因工程技术连接起来,构建重组腺病毒载体Ad5-VIE及Ad5-SIV,通过一系列体外实验及部分体内实验,初步探讨以GGC肽编码序列及HSV1-sr39tk作为报告基因监测治疗基因VEGF基因表达的可行性,并且对两种报告基因显像的优缺点进行分析。 方法: 1.GGC/99mTc-GH报告基因系统监测治疗基因VEGF165表达的研究 1)重组腺病毒Ad5-VIE的构建及鉴定 pcDNA3-VEGF165质粒线性化后,化学合成GGC肽基因序列,之后将GGC肽基因序列连于VEGF165基因C端,通过内部核糖体切入位点(internal ribosomal entry site,IRES)技术将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresce protein, EGFP)基因连接至下游,最后构建成重组腺病毒载体(Ad5-VIE)。 2)重组腺病毒(Ad5-VIE)感染大鼠骨髓间充质细胞后摄取99mTc-GH的实验研究 Ad5-VIE转染大鼠骨髓间充质细胞后48h,每孔加入含有99mTc-GH的培养基,37℃条件下按照实验要求进行孵育不同时间。分别进行时间相关(MOI=100,孵育时间分别为30min,60min,90min,120min)及感染复数(Multiplicity of Infection, MOI=0,10,25,50,100,孵育时间为2h)相关摄取实验。 3)实时定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)鉴定重组腺病毒感染MSCs后VEGF165及EGFP的表达 Ad5-VIE以不同滴度(MOI=0,10,25,50,100)转染大鼠骨髓间充质细胞后48h,提取每孔总RNA逆转录后进行qRT-PCR扩增实验,检测VEGF165及EGFP在mRNA水平上的表达。 4)半定量Western-blot;检测病毒转染后VEGF165蛋白的表达 Ad5-VIE不同MOI(0,10,25,50,100IU/per cell)转染MSCs后48h,提取每孔细胞胞浆蛋白,进行Western-blot蛋白印迹实验,将Western-blot结果与不同MOI细胞摄取结果进行对比分析,从而判断GGC肽与VEGF165蛋白的表达相关性。 5)报告基因体内显像的初步应用研究: 将2.5×108IU重组腺病毒Ad5-VIE与Ad5-EGFP转染大鼠骨髓间充质细胞中(1×107cells),转染24h后,胰酶消化后收集细胞,生理盐水制成250ul细胞悬液,将其多点注射于SD大鼠下肢中,48h后采用低能针孔准直器进行SPECT显像。 2.报告基因系统HSVl-sr39tk/FIAU监测治疗基因VEGF165表达的研究 1)重组腺病毒Ad5-SIV的构建及鉴定。 通过IRES技术将报告基因HSV1-sr39tk与治疗基因VEGF165连接起来,构建重组腺病毒载体Ad5-SIV。并且通过PCR等方法来鉴定其构建成功与否。 2)Ad5-SIV感染MSCs后摄取131I-FIAU的实验研究。 Ad5-SIV以不同滴度(MOI=0,10,25,50,50,75,100)转染MSCs后48h,与含131I-FIAU的培养基孵育3h,测量其摄取率;同时以MOI=50感染MSCs,测量不同时间(0,30,60,90,120,150,180min,240min摄取率。 3)qRT-PCR鉴定重组腺病毒感染MSCs后HSVl-sr39tk,及VEGF165 mRNA的表达 Ad5-SIV以不同滴度(MOI=0,10,25,50,75,100)转染MSCs后48h,提取每孔总蛋白逆转录后进行QRT-PCR实验,检测HSV1-sr39tk mRNA及VEGF165 mRNA的含量。 4)酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测不同感染复数Ad5-SIV转染MSCs后细胞培养上清中VEGF的含量 Ad5-SIV以不同滴度(MOI=0,10,25,50,75,100)转染MSCs后48h,提取每孔细胞培养上清,2000rpm离心20min,按照ELISA试剂盒说明书进行操作,检测转染不同感染复数病毒后细胞培养上清中VEGF的含量,并且将ELISA结果与细胞摄取结果做对比分析,从而检测报告基因HSV1-sr39TK酶活性与VEGF表达之间的关系。 结果: 1.GGC/99mTc-GH报告基因系统监测治疗基因VEGF165表达的研究 1)Ad5-VIE重组腺病毒的构建及鉴定 重组质粒PDC316-VEGFGGCmotif-IRES-EGFP经过PCR、酶切及测序等手段均证实其序列正确,包装生成的重组腺病毒Ad5-VIE毒种经PCR实验能扩增出预期条带,经纯化后物理滴度为2×1011(v.p/ml),感染滴度为(TCID50法)为4.5×109IU/ml。 2)Ad5-VIE感染MSCs后摄取99mTc-GH实验 时间相关摄取实验结果显示转染了包含目的基因重组腺病毒的MSCs细胞对99mTc-GH的摄取率逐渐增高,至120min时达到7.72±0.22%;转染了对照病毒Ad5-EGFP各时间点摄取值均处于较低水平。滴度相关摄取实验结果显示细胞对99mTc-GH的摄取率随病毒滴度的增加而逐渐增加(r2=0.86,P0.05) 3)Ad5-VIE感染MSCs后VEGF165及EGFP的mRNA表达 不同滴度感染后,VEGF165及EGFP的mRNA含量随病毒感染滴度增加而增加,二者之间呈线性正相关(r2分别为0.91和0.90,P0.05),并且VEGF165及EGFP的mRNA表达之间亦具备显著正相关(r2=0.99, P0.05)。 4)Ad5-VIE感染后半定量western-blot检测VEGF165的表达 半定量western-blot结果显示Ad5-VIE以不同滴度感染MSCs48h后,细胞胞浆中VEGF165蛋白表达逐步上升,而在对照病毒Ad5-EGFP组及空白对照组未见表达。VEGF165相对量与细胞摄取率均随病毒滴度增高逐步增高,二者呈正相关(r2=0.90,P0.05),说明VEGF165蛋白与GGC肽表达之间具有较好的相关性。 5)报告基因显像体内显像的初步研究 体内显像可见大鼠尾静脉注射99mTc-GH后,双侧肾脏及左侧下肢(感染Ad5-VIE细胞组)5min立即显影并且显影清晰,随着显像剂排出,膀胱显影逐渐清晰,左侧下肢显影逐渐模糊,2h左右,显影近乎消失。而在转染Ad5-EGFP细胞组,MSCs细胞组,生理盐水组未见明显显影。 2.报告基因系统HSV1-sr39tk/FIAU.监测治疗基因VEGF165表达的研究 1)Ad5-SIV重组腺病毒的构建及鉴定 重组质粒PDC316-sr39tk-IRES-VEGF 165经过PCR,酶切及测序均证实其序列正确,并且包装生成的重组腺病毒Ad5-SIV毒种经PCR实验能扩增出预期条带,经纯化后物理滴度为2×1011(v.p/ml),感染滴度为(TCID50法)为7.9×109IU/ml。 2)Ad5-SIV感染MSCs后摄取实验 随着时间延长,转染Ad5-SIV组细胞摄取率逐步升高,150min时达平台期,此时摄取率为20.06±1.33%。而对照组摄取一直处于低水平。病毒感染滴度相关摄取实验结果显示,细胞摄取率随病毒滴度的增加而逐渐增加(r2=0.89,P0.05)。 3)Ad5-SIV感染MSCs后VEGF165及EGFP的mRNA表达 不同滴度感染后,HSV1-sr39tk及VEGF 165 mRNA含量随病毒感染滴度增加而增加,二者之间呈线性正相关(r2分别为0.97和0.96,P<0.05),并且HSV1-sr39tk及VEGF 165 mRNA表达之间亦具备显著正相关(r2=0.94,P0.05)。 4)Ad5-SIV感染后ELISA检测VEGF165的表达 ELISA结果证实VEGF165蛋白分泌随病毒滴度增大而增加(r2=0.99,P0.05)。将VEGF165蛋白分泌结果与病毒滴度相关摄取结果做相关性分析,可以反映VEGF蛋白分泌与HSV1-sr39TK蛋白酶活性之间的关系,二者之间具有较好的相关性(r2=0.84,P0.05)。 结论:本研究成功构建了重组腺病毒Ad5-VIE及Ad5-SIV,并且通过体外研究证实转染了目的病毒的MSCs细胞对报告探针99mTc-GH及131I-FIAU的摄取均与治疗基因VEGF165表达呈正相关。从而使利用报告基因系统来检测治疗基因的表达成为可能。


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