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新型突变mucA基因编码蛋白的亚细胞定位、对生物被膜形成的影响及其机制的探讨

陈安群  
【摘要】: 目的:探讨新型突变mucA56基因编码蛋白的亚细胞定位,并观察mucA56基因对生物被膜形成的影响,探讨mucA56基因影响生物被膜形成的机制。方法:采用Ncol和XbaI酶切位点的引物,从pMD18T-HR扩增mucA56基因的全长克隆到pMF54构建pCAQ56, XbaI单酶切pPH07载体中的碱性磷酸酶基因全长插入到pCAQ56的开放阅读框中,构建mucA56-phoA融合表达载体pCAQ57。对构建的pCAQ57载体进行PCR鉴定及序列测定,并使用碱性磷酸酶抗体验证融合蛋白的表达。将pCAQ57、pKMG170阴性对照质粒)、pKMG176(阳性对照质粒)分别转化大肠杆菌和铜绿假单胞菌,划线接种在含有碱性磷酸酶作用底物BCIP的LB琼脂平板上,观察各自菌落颜色以评估碱性磷酸酶活性;从pGFPuv质粒中扩增表达增强型绿色荧光蛋白的基因全长,克隆入大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭质粒(pUCP20),构建一个稳定的铜绿假单胞菌绿色荧光蛋白表达载体(pUCP20/GFPuv),采用电转化的方式将pUCP20/GFPuv导入到铜绿假单胞菌PAOl、PDO300(含经典突变mucA22基因的粘液型PA01同源菌株)、PAOmucA56(含新型突变mucA56基因的粘液型PAO1同源菌株)中,采用改良的流动介质体外培养生物被膜,应用激光共聚焦显微镜观察生物被膜形成第l、3、5天的形态和结构;收集三者生物被膜形成第一、三、五天的生物被膜细菌,提取细菌全蛋白进行蛋白质二维电泳,找出PA01、PAOmucA56表达水平相同而与PDO300表达水平差异的蛋白点,采用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF MS)分析差异蛋白质。 结果:对构建的融合表达载体pCAQ57进行PCR鉴定及序列测定,结果表明phoA基因正向插入到mucA56的开放阅码框中;Western Blot进一步证实了融合蛋白的表达;以上提示成功构建了mucA56-phoA融合蛋白表达载体pCAQ57。转化了pCAQ57的大肠杆菌和铜绿假单胞菌,以及转化了pKMG170的大肠杆菌和铜绿假单胞菌,在含有碱性磷酸酶作用底物BCIP的LB琼脂平板上,均表现为白色菌落,提示为无活性的碱性磷酸酶活动。而转化了pKMG176的大肠杆菌和铜绿假单胞菌,在含有碱性磷酸酶作用底物BCIP的LB琼脂平板上均表现为蓝色菌落,提示为有活性的碱性磷酸酶活动;激光共聚焦显微镜观察PAOmucA56、PA01、PD0300第1、3、5天生物被膜形态,结果显示:PAOmucA56、PAO1的形成方式为水平铺散,其成熟生物被膜形态为均一的薄膜状,基质覆盖完全,PAOmucA56戎熟生物被膜平均厚度约为30μm,PAO1成熟生物被膜平均厚度约为25μm;PDO300的形成方式为局部堆积,呈山丘状,成熟生物被膜具有很大的异质性,以低的基质覆盖和大的微生物菌落间隔为特点,生物被膜最高厚度约为36μm。生物被膜形成第一天、第三天、第五天的生物被膜细菌全蛋白二维电泳,PAO1和PAOmucA56表达相同而与PDO300差异表达的蛋白点分别有8个、6个、15个。29个蛋白的质谱分析结果表明,有12个蛋白的质谱分析结果可信度不高(MS66)。筛选出来的17个候选蛋白中,DNA指导的RNA聚合酶p亚单位、谷氨酰胺合成酶、延长因子Tu、DNA指导的RNA聚合酶α亚单位、内肽酶Clp2、延长因子G1、热休克蛋白HtpG、ATP依赖的Clp蛋白ATP结合亚单位clpX、触发因子在PDO300中相对低表达,而30S核糖体蛋白S18、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、丙酮酸脱氢酶复合物二氢硫辛酰赖氨酸基乙酰转移酶、PasP、生物素羧化酶、精氨酸脱亚氨酸、鸟氨酸氨甲酰转移酶、丝氨酸羟甲基转移酶3在PD0300中相对高表达;其中clp蛋白酶家族(内肽酶Clp2和ATP依赖的Clp蛋白ATP结合亚单位clpX)分别在第三天、第五天生物被膜细菌中有PD0300的相对低表达。 结论:mucA56基因编码的产物定位在细胞质;藻酸盐可以影响生物被膜结构,而mucA56基因存在藻酸盐以外的途径影响生物被膜的形成;mucA56基因是一个多效调节基因,其调节范围涉及细菌的压力应激、藻酸盐合成等很多方面。clp蛋白酶家族的差异表达可能是PAOmucA56生物被膜形态特殊的重要原因。


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