Wnt信号通路对NIT-1胰岛β细胞的作用及机制

【摘要】： 第一部分 Wnt3a对小鼠NIT-1胰岛β细胞的作用 [目的]通过体外培养小鼠胰岛细胞瘤细胞NIT-1细胞,观察Wnt3a对NIT-1细胞的增殖、凋亡及胰岛素分泌功能的影响。 [方法]体外培养小鼠NIT-1胰岛β细胞,用高糖(33.3 mmol/L)刺激NIT-1细胞96小时,或细胞因子混合物(IL-1β10 ng/ml+TNF-α50 ng/ml+IFN-γ50 ng/ml)刺激NIT-1细胞18小时,诱导NIT细胞凋亡增加；同时以纯化重组的Wnt3a (100ng/ml)蛋白孵育正常及高糖或细胞因子介导损伤的NIT-1细胞24小时,诱导激活Wnt信号通路。BrdU方法检测细胞增殖,Tunnel及PI-Annexin V. (Annexin-V-FITC/PI)双染流式凋亡检测,放免法检测细胞胰岛素分泌。 [结果]高糖刺激后诱导细胞凋亡率增加为正常对照组1.7倍,细胞因子刺激后可诱导细胞凋亡率增加为正常对照组1.9倍,差异有显著性,P0.001；给予Wnt3a蛋白干预后,正常组细胞增殖率增加58%,高糖组细胞增殖率增加51%,细胞因子组细胞增殖率增加75%,与对照组相比,差异有显著性,P0.001; Wnt3a蛋白干预后,正常组细胞凋亡率减少32%,高糖组凋亡率较少35%,细胞因子组凋亡率较少45%,差异有显著性,P0.001；胰岛素分泌功能较对照组改善,P0.05。 [结论]Wnt3a能够促进NIT-1胰岛β细胞的增殖,减少其凋亡,改善细胞的胰岛素分泌功能。 第二部分 Wnt/β-catenin/TCF信号通路对NIT-1保护作用的初步探讨 [目的]探讨Wnt信号通路对胰岛β细胞存活及功能的保护作用的分子生物学机制。 [方法]体外培养小鼠NIT-1胰岛β细胞,以重组纯化Wnt3a蛋白激活Wnt信号通路,real-time PCR分析LRP-5, GSK3β,β-catenin, TCF7L2等Wnt信号通路中关键因子的改变,检测细胞存活促进因子Bcl-2,和细胞周期调节因子Pitx2, CyclinD2,胰岛素分泌相关基因PDX-1, GLUT2, Glucokinase (GK)的表达。并探讨与胰岛β细胞生长和功能密切相关基因.,IRS-2和IRS-1的表达状况。Western Blotting检测β-catenin, IRS-1, IRS-2的蛋白水平。并且所有组均给予Wnt通路阻断剂Dkk1(160 ng/ml)干预对比,观察Wnt3a对β细胞的促进作用对Dkk1的敏感性。 [结果]Wnt3a蛋白干预后,NIT-1细胞的TCF7L2 mRNA水平上调为对照组4-5倍,β-catenin游离蛋白水平为对照组1.5倍。与细胞增殖相关基因Pitx2、CyclinD2 mRNA表达增加为对照组4-5倍和1.6倍,细胞存活促进因子Bcl-2表达增加为对照组1.2倍,胰岛素相关基因PDX-1, Glucokinase (GK) mRNA表达增加,Wnt3a蛋白干预组为正常对照组2倍和1.5倍：GLUT2 mRNA水平Wnt3a蛋白组与对照组相比无明显改变,IRS-2的mRNA及蛋白水平都显著增加,分别为对照组10-11倍和2-3倍；IRS-1表达无明显改变。Dkk1可以显著抑制Wnt3a对NIT-1细胞的上述作用,P0.05。 [结论]Wnt3a通过激活Wnt/β-catenin/TCF经典信号通路,使β-catenin游离增多,进入核内,与TCF7L2结合,并激活TCF7L2转录活性,促进Wnt通路下游相关靶基因Pitx2、Cyclin D2、Bcl-2的表达促进细胞的增殖,保护细胞的凋亡,上调PDX-1和GK的表达,改善β胰岛素分泌功能。而且,Wnt3a作用于NIT-1细胞后,使NIT-1细胞的IRS-2表达明显上调。Dkk1可以显著抑制Wnt3a对NIT-1细胞的上述作用。 第三部分 IRS-2/PI3K/AKT介导Wnt/β-catenin/TCF对NIT-1细胞作用的分子生物学机制 [目的]研究胰岛素信号通路IRS-2/PI3K/AKT在Wnt3a对胰岛p细胞作用中的地位,进一步探讨Wnt信号通路对NIT-1胰岛β细胞作用的生物学机制。 [方法]Wnt3a激活NIT-1细胞的Wnt信号通路,流式检测细胞增殖及凋亡,放免法检测NIT-1细胞胰岛素分泌功能(GSIS)。Real-time PCR及Western Blotting检测IRS-2/PI3K/AKT信号通路中IRS-2、磷酸化AKT和GSK3β蛋白水平；并分别给予Wnt通路阻断剂Dkk1(160ng/ml)及PI3K阻断剂wortmannin (100nmol/L),流式检测相应的细胞增殖及凋亡变化；荧光定量PCR及Western Blotting检测Wnt信号通路中β-catenin、TCF7L2表达量及IRS-2/PI3K通路中IRS-2、p-AKT、p-GSK3β的表达及磷酸化水平对阻断剂Dkk1和wortmannin的敏感性。 [结果]Wnt3a激活Wnt经典信号通路后,IRS-2蛋白表达水平增加为对照组2-3倍,p-AKT表达增加60%,相应,β细胞增殖率增加73%,凋亡率减少25%,胰岛素分泌功能明显改善,差异有显著性,P0.05; Dkk1可以阻断外源性Wnt3a所引起的Wnt/beta-catenin/TCF及IRS-2/PI3K/AKT通路活性改变(与Wnt3a组相比,IRS-2表达下降47%, p-AKT表达下降30%),阻断Wnt3a对NIT-1细胞的增殖与凋亡的正性调节(与Wnt3a组相比,凋亡率增加45%,增殖率下降47%); wortmannin可以明显抑制IRS-2/PI3K/AKT通路中p-AKT水平的增加(减少37%,),不影响β-catenin与TCF7L2的表达,可显著抑制Wnt3a对胰岛p细胞的促进作用(与Wnt3a组相比,凋亡率增加34%,增殖率下降33%,差异有显著性),而且,Dkk1对Wnt3a的抑制作用要比wortmannin显著,差异有显著性,P0.05。Wnt3a可以改善NIT-1细胞在基础(2.8mM)和高糖(16.7 mM)刺激下的胰岛素分泌功能,给予Wnt通路的阻断剂Dkk1或PI3K通路阻断剂Wortmannin后,Wnt3a对NIT-1细胞在基础和高糖刺激下的胰岛素分泌的刺激作用均被抑制。 [结论]IRS-2/PI3K/AKT可能部分介导了Wnt/β-catenin/TCF对胰岛β细胞的促进和保护作用。