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肿瘤微环境中F4/80~+CD11b~+Gr-1~+单核细胞活化机制的研究

刘颜颜  
【摘要】: 既往认为巨噬细胞能分泌多种细胞因子,通过抑制肿瘤细胞生长及促进T细胞凋亡等机制产生肿瘤抑制作用。但近年来研究发现肿瘤微环境中的巨噬细胞虽然也能分泌多种细胞因子但却失去了对肿瘤细胞的反应性,同时巨噬细胞的某些表型也发生了一定的改变,它的功能从抑制肿瘤细胞生长转变为促进肿瘤细胞生长。作为巨噬细胞的前体细胞,骨髓来源的单核细胞(bone marrow-derived monocytes, BMDMs),即F4/80+CD11b+细胞及其相关产物在肿瘤细胞的生长与转移过程中发挥着重要的作用,但其活化机制及产生促瘤功能的机理至今尚不清楚。 在此研究中,我们首先发现与肿瘤细胞相互作用后的巨噬细胞可促进肿瘤细胞的生长,且其促进肿瘤生长的功能并不依赖于巨噬细胞与肿瘤细胞间的相互接触,而是由于二者在相互作用的过程中释放出的某些物质所引起。同时发现与大量肿瘤细胞相互作用后的巨噬细胞可促进肿瘤细胞的生长,而与小量肿瘤细胞相互作用后的巨噬细胞并没有产生促肿瘤细胞生长的作用。我们推测可能是由于肿瘤细胞大量死亡后的释放物对巨噬细胞产生了影响。因此我们采用了反复冻融法制备坏死肿瘤细胞释放物(molecules from necrotic tumor cells, NTC-Ms)模拟肿瘤微环境进行研究,证实了在肿瘤微环境中巨噬细胞具有促进肿瘤生长的生物学功能。 通过进一步分析肿瘤组织单个细胞、不同肿瘤小鼠骨髓来源的F4/80+CD11b+细胞和肿瘤组织培养上清趋化而来的F4/80+CDllb+外周血单核细胞发现它们均为Gr-1+。我们推测肿瘤组织释放趋化因子使骨髓中未成熟单核细胞(F4/80+CD11b+Gr-1+细胞)入血,并阻碍其进一步分化成熟,使其丧失单核/巨噬细胞的杀肿瘤细胞功能,成为肿瘤‘相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAMs)的前体细胞。在随后的研究中发现,经NTC-Ms处理后的正常小鼠骨髓细胞转变成为具有免疫抑制表型的细胞,表达精氨酸酶I (Arginase 1,ArgI)和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitricoxide synthase, iNOS or Nos2),同时分泌白细胞介素10(interleukin-10, IL-10)和白细胞介素-12(interleukin-12, IL-12),并可抑制活化的CD4+和CD8+T细胞的增殖。由此可见,肿瘤组织中的F4/80+CDllb+Gr-1+细胞在保留其单核细胞表面标志的情况下,其功能已发生改变。 接着我们探究了F4/80+CDllb+Gr-1+细胞功能发生改变及活化的原因。首先我们发现正常小鼠骨髓来源的单核细胞(normal bone marrow-derived monocytes, N-BMDMs)、肿瘤小鼠骨髓来源的单核细胞(tumor-bearing bone marrow-derived monocytes, T-BMDMs)和TAMs中F4/80+CD11b+Gr-1+细胞均表达TLR2和TLR4,故我们研究了其下游的核转录因子,结果显示NTC-Ms不能有效激活NF-κB而仅能活化IRF-3,表明在BMDMs中MyD88依赖的信号转导途径是缺失的,NTC-Ms可能是通过TRIF信号转导途径对BMDMs发挥作用。我们进一步采用了Toll-白细胞介素-1受体结构域诱导干扰素接头分子(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β, TRIF)通路的特异性抑制剂白藜芦醇(resveratrol, Res),发现Res可明显抑制由NTC-Ms引起的Arg1、Nos2、IL-10和IL-12的表达变化,也可抑制由NTC-Ms引起的活化的T细胞凋亡,提示NTC-Ms可能是通过TLR4介导的信号转导途径而产生生物学作用。在此基础上,去除NTC-Ms中的RNA成分后对IRF-3的激活以及Arg1、Nos2、IL-10和IL-12的表达并无影响,证实RNA并没有参与这个过程。这些结果共同说明,NTC-Ms对BMDMs的活化可能是通过NTC-Ms中的蛋白质成分激活TLR4的MyD88非依赖途径的信号转导完成的。 在MyD88途径缺陷的情况下,完全活化骨髓细胞需要TLR4和IFN-y的共同作用,接下来我们研究肿瘤微环境中的IFN-y在BMDMs分化中的作用。在研究中发现IFN-y可抑制BMDMs诱导的活化T细胞的凋亡,从而抑制肿瘤的生长和转移。但随着肿瘤的生长,在IFN-y受体表达量不变的情况下T-BMDMs对IFN-y的反应性越来越低,因此我们推测肿瘤微环境可能降低了T-BMDMs对IFN-y的反应性。我们同时观察到IL-10可抑制NTC-Ms诱导的Nos2和IL-12的表达并且对由NTC-Ms刺激后N-BMDMs诱导的CD4+和CD8+T细胞的凋亡有明显的协同作用。western-blot结果显示,IFN-y可活化N-BMDMs和T-BMDMs磷酸化STAT1,而IL-10则活化磷酸化STAT3的表达。这些结果说明,在肿瘤微环境中,由于T-BMDMs对IFN-y反应性越来越低而IL-10分泌不断增加,使得STAT1活化减少而STAT3大量激活,最终导致CD4+和CD8+T细胞产生凋亡进而产生免疫耐受、抑制Nos2和IL-12的表达使F4/80+CDllb+Gr-1+细胞向M2表型转换。 综上所述,在本研究中我们对肿瘤微环境对F4/80+CD11b+Gr-1+细胞的影响、F4/80+CD11b+Gr-1+细胞的来源、TLRs在F4/80+CD11b+Gr-1+细胞活化过程中的作用以及IFN-y和IL-10在F4/80+CDllb+Gr-1+细胞活化中的机制等方面进行了探讨,初步明确了在肿瘤微环境的影响下F4/80+CD11b+Gr-1+细胞活化的过程及其相关信号转导途径,为我们下一步针对其关键环节进行靶向治疗提供了理论依据。


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