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洋葱伯克霍尔德菌的筛选、鉴定及其脂肪酶基因的高效表达

贾彬  
【摘要】: 生物柴油是解决目前石化能源危机的重要途径之一,其中脂肪酶催化法制备生物柴油技术具有反应条件温和、转化效率高、绿色环保无污染等优点,符合国家的新能源发展战略,前景广阔。但昂贵的脂肪酶价格限制了酶法生物柴油制备技术的推广和工业化。 本研究筛选到一株产耐热、耐短链醇脂肪酶的洋葱伯克霍尔德菌(Burholderia cepacia) G63,分子生物学鉴定其属于B. cenocepacia。B. cenocepacia G63脂肪酶水解橄榄油的最适pH为9.0,最适温度为60℃,在pH 6.0-10.0以及65℃以下都十分稳定,60℃温育4 h后仍保留80%以上的酶活力。该酶对乙醇、丙醇和异丙醇等多种短链醇的耐受性极佳。这些特性表明B. cenocepacia G63脂肪酶是催化制备生物柴油的理想用酶。摇瓶发酵的G63平均产酶量为12.4 U/mL。论文就提高G63脂肪酶的表达量进行了一系列分子生物学研究,B. cenocepacia G63脂肪酶在重组大肠杆菌中的表达量达到50 mg/g cell-wet weight,在B. cenocepacia同源重组工程菌BC-T7Aliplif中水解橄榄油的酶活最高达32.7 U/mL,在毕赤酵母基因工程菌中水解pNPP酯的酶活最高达184.3 U/mL。上述结果表明本研究所建立的脂肪酶基因改造和表达技术路线是正确的。 本论文的主要工作及创新点如下: 1.建立了TB-TA平板定向筛选方法。该法筛选洋葱伯克霍尔德菌(Burholderia cepacia)阳性率高达100%,非常适合该菌的规模化筛选。并使用Haelll-recA RFLP (restriction fragment length polymorphism)和亚种特异性PCR的方法将G63鉴定为B. cenocepacia,是首次鉴定到亚种水平的BCC脂肪酶生产菌。 2.扩增了G63脂肪酶及其折叠酶的基因并在大肠杆菌中实现了大量表达。根据生物信息学方法对信号肽预测的结果,将脂肪酶基因去除信号肽部分后在pet系统中表达,在胞内表达成包涵体,随后采用超声波破碎、脱氧胆酸钠溶解细胞碎片的简单方法制备出高纯度脂肪酶包涵体。蛋白质含量测定表明脂肪酶的表达量达到50mg/g cell-wet weight。根据蛋白质跨膜区域预测的结果,删除折叠酶N端跨膜的70个氨基酸,成功以pet系统在E. coli中实现折叠酶的可溶性表达,随后利用Ni-NTA金属亲和层析法一步纯化出N端携带6×His标签的折叠酶。 3.进行脂肪酶的体外复性研究。证实折叠酶辅助法的复性效率明显优于大量稀释法。在对折叠酶-脂肪酶摩尔比、复性pH和复性时间等因素进行研究后得出,B.cenocepacia脂肪酶体外最佳复性条件为pH7.2,折叠酶-脂肪酶摩尔比1:1,复性时间12 h,复性后脂肪酶比活力最高为473.8 U/mg,复性效果良好。 4.将T7蛋白质表达系统导入B. cenocepacia菌并实现了脂肪酶的高效同源表达。该系统以B. cenocepacia G63为宿主菌,通过同源重组的方法把T7RNA聚合酶基因定向插入到B. cenocepacia基因组中脂肪酶启动子的后面,使T7RNA聚合酶的表达受到脂肪酶启动子的调控,然后将受T7启动子调控的脂肪酶基因以质粒形式进行表达,最终实现了脂肪酶的高效表达。整个表达系统可分成T7 RNA聚合酶整合型重组菌和脂肪酶表达载体两部分。 T7重组菌的构建通过自杀质粒pJQ200SK介导。先把脂肪酶操纵子前后两段500bp序列分别融合到T7 RNA聚合酶基因两端,再将此杂合基因克隆到pJQ200SK中,然后通过三亲本杂交将构建的自杀质粒导入野生菌。自杀质粒与野生菌基因组在500bp同源区域发生同源重组,从而将T7 RNA聚合酶基因整合于B. cenocepacia基因组中,获得T7重组菌。T7启动子型表达载体共有4种,其中pBBR221ip和pBBR221iplif采用脂肪酶自身信号肽,pBBR22△lip和pBBR22△liplif采用pelB信号肽。实验结果表明pelB分泌信号比脂肪酶原始分泌信号更适合于脂肪酶的表达与分泌。通过电转化将表达质粒转入T7重组菌获得4种脂肪酶工程菌。B. cenocepacia脂肪酶工程菌的这种构建方法系本文首创。 5.在毕赤酵母中初步实现了B. cenocepacia脂肪酶的活性分泌表达。在生物信息学分析的基础上,采用重叠PCR技术改造了B. cenocepacia脂肪酶基因结构,获得适于在毕赤酵母中表达的优化基因。使用pGAPZa和pPIC9K分别构建了组成型和诱导型毕赤酵母基因工程菌。发酵结果表明,GAP启动子更适合该脂肪酶的高效表达,脂肪酶水解pNPP酯的最高酶活力达到184.3 U/mL。初步酶学性质研究表明,毕赤酵母表达的脂肪酶与野生型脂肪酶性质基本相同,可以用于规模生产。


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