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缝隙连接在长QT综合征室性心律失常发生中的作用及其机制研究

全小庆  
【摘要】: 长QT综合征(Long QT Syndrome, LQTS)是一种先天遗传性,或者后天获得的心脏复极延迟的疾病。长QT综合征表现为心电图上QT间期延长,它可以引起室性早搏及尖端扭转性室速(Torsade de Pointes, TdP)等致命性的心律失常,心源性晕厥和猝死为长QT综合征常见并发症。长QT综合征患者心电图上QT间期异常延长,临床上长QT综合征患者反复发生心源性晕厥、并常导致猝死的发生。 近年来许多研究表明,除了心脏复极时程的延长以外,跨室壁复极离散度(transmural dispersion of repolarization,TDR)的增加在长QT综合征早期后除极(early afterdepolarization, EAD)的产生,以及心律失常TdP的诱发和维持中也起着重要作用。长QT综合征中增大的TDR可使得EAD能够跨室壁传导,EAD跨室壁传导导致心脏的触发活动(比如R-on-T期前收缩)和致命性的心律失常TdP的产生。长QT综合征TDR的增加同时也可以通过二相折返的机制来维持TdP的发生。心脏各层心肌细胞有着显著的电生理特性和功能上的差异,近年来一些研究表明心室壁各层心肌细胞表面离子通道表达和功能的差异,使得跨室壁复极离散度异常增加。 心脏各层心肌细胞有着显著的电生理特性和功能上的差异导致了跨室壁复极离散度的形成,而心肌细胞间之间通过缝隙连接耦连。心肌细胞的缝隙连接位于闰盘处,动作电位通过缝隙连接从一个细胞扩布到相邻的细胞。跨膜离子及小分子物质可通过心肌细胞的缝隙连接直接交换,心肌细胞的缝隙连接在维持正常的心脏节律和细胞间的代谢物交换方面扮演着重要角色。由于整体心脏中心肌细胞间存在缝隙连接,小分子物质通过缝隙连接顺着电化学梯度在心肌细胞间传递,从而减少了心肌细胞间的电生理异质性。在整体心脏中,由于心肌细胞间良好的缝隙连接耦连,使得跨室壁复极的差异小于单个心肌细胞间动作电位时程的差异。近来有研究结果显示,在正常和心衰的心脏中,缝隙连接蛋白Cx43的表达、分布和磷酸化均影响了跨室壁复极的异质性。缝隙连接蛋白磷酸化状态的改变可影响缝隙连接通道的开放和代谢,造成缝隙连接的解耦连和功能下降。Carbenoxolone(缝隙连接解耦连剂)可增加复极离散度,而增加各层心肌细胞间缝隙连接的耦连,可减少跨室壁复极时程的差异。缝隙连接耦连增强剂抗心律失常肽AAP10和HP-5能够增加缝隙连接功能,进而减少动作电位时程的离散度。增加心肌细胞间缝隙连接的耦连,可以防止病理状态跨室壁复极离散度的异常增加。 心肌肥厚和心衰等多种心脏疾病的跨室壁复极离散度增加,同时其伴有心肌细胞间缝隙连接失耦连。这些研究结果表明改变心肌细胞间缝隙连接耦连,可能影响心脏各层心肌细胞间复极特性的差异的大小。因而我们推测增加心脏心肌细胞间缝隙连接的耦连,可以减少跨室壁复极离散度,进而预防长QT综合征室性心律失常的发生。本研究检测了缝隙连接激动剂抗心律失常肽(AAP10)对兔LQT3和犬LQT2模型跨室壁复极离散度和室性心律失常的影响并探讨其作用机制。 第一部分抗心律失常肽对兔LQT3模型缝隙连接耦连和室性心律失常的影响 目的:跨室壁复极离散度(transmural dispersion of repolarization, TDR)的增加可导致长QT综合征心律失常的发生。心肌细胞的缝隙连接也参与了跨室壁复极离散度的形成和维持。本实验研究了缝隙连接激动剂抗心律失常肽(AAP10),对兔LQT3模型缝隙连接磷酸化,以及室性心律失常的影响并探讨其作用机制。 方法:心肌细胞钠通道开放剂海葵毒素ATX-Ⅱ(20 nM, Calbiochem Corp., La Jolla,CA,USA)和兔左室楔型心肌块用于建立LQT3模型。抗心律失常肽AAP10(缝隙连接激动剂,Chinese Peptide Co., Hangzhou, Zhejiang, China)用于增加心肌细胞间缝隙连接耦连。采用浮置玻璃微电极法,同步记录心外膜、心内膜心肌细胞跨膜动作电位,同时记录跨室壁心电图。免疫印迹法(Western blot)检测心肌细胞缝隙连接蛋白43(Connexin43, Cx43)去磷酸化水平的变化。 基础步长1000 ms起搏1小时(电生理稳定),药物均溶解于台氏液,通过左室楔型心肌组织块冠状动脉插管灌流。左室楔型心肌组织块随机分为正常组、LQT3组、AAP-100nM和AAP-500nM干预组:正常组灌流正常台式液(n=10)、LQT3组灌流含20 nM ATX-Ⅱ的台式液(n=10)、AAP-100nM干预组灌流含20 nM ATX-Ⅱ和100 nMAAP10的台式液(n=10)、AAP-500nM干预组灌流含20 nM ATX-Ⅱ和500 nM AAP10的台式液(n=10)。 在基础状态下、AAP10预处理时和灌流ATX-Ⅱ的LQT3阶段,观察并记录左室楔型心肌组织块自发性心律失常,以及程序刺激诱发的左室楔型心肌组织块心律失常。QT间期为起搏信号到T波下降支与基线交叉点间的距离;动作电位复极90%时程(APD90)为动作电位0期到复极至90%振幅的时程;跨室壁复极离散度(TDR)为同一心搏心内膜和心外膜复极时间差值。 结果:与正常组相比较,LQT3组QT间期和跨室壁复极离散度(TDR)显著增大。LQT3组早期后除极(EAD),R-on-T期前收缩,尖端扭转性室速(TdP)的发生率也显著高于正常组,并伴有去磷酸化Cx43水平增高(均P0.001)。正常组未发生早期后除极(EAD),R-on-T期前收缩,尖端扭转性室速(TdP)。与正常组相比较,LQT3组中10/10产生EAD,10/10产生R-on-T期前收缩(P0.001)。LQT3组有5/10出现自发性TdP(P=0.033),9/10诱发出TdP(P0.001)。与LQT3组相比较,AAP-500nM干预组的QT间期以及TDR显著缩短(均P0.001)。AAP-500nM干预组的早期后除极(EAD),R-on-T期前收缩,尖端扭转性室速(TdP)发生率显著小于LQT3组(P=0.003,P=0.001,P=0.02),AAP-500nM干预组伴随Cx43去磷酸化水平降低(P0.001)。 结论:缝隙连接激动剂AAP10防止Cx43去磷酸化,减少了兔LQT3模型的跨室壁复极离散度和心律失常发生率,说明兔LQT3模型的缝隙连接可能参与了跨室壁复极离散度的形成。 第二部分抗心律失常肽对犬LQT2模型缝隙连接重构和室性心律失常的影响 目的:跨室壁复极离散度(transmural dispersion of repolarization, TDR)的增加可导致长QT综合征心律失常的发生。心肌细胞的缝隙连接也参与了跨室壁复极离散度的形成和维持。本实验研究了缝隙连接激动剂抗心律失常肽(AAP10),对犬LQT2模型缝隙连接磷酸化,以及室性心律失常的影响并探讨其作用机制。 方法:应用心肌细胞IKr通道阻断剂d-sotalol (100μM, Sigma, St. Louis, MO, USA)在犬左室楔型心肌块建立LQT2模型。抗心律失常肽AAP10(缝隙连接激动剂,ChinesePeptide Co., Hangzhou, Zhejiang, China)用于增加心肌细胞间缝隙连接耦连。采用浮置玻璃微电极法同步记录心内膜、中层(M细胞)和心外膜心肌细胞跨膜动作电位及跨室壁心电图。免疫印迹法(Western blot)检测心肌细胞缝隙连接蛋白43 (Connexin43,Cx43)总的Cx43和去磷酸化Cx43水平的变化。应用荧光免疫组化技术检测上述各组心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43表达、空间分布和磷酸化水平的改变。 基础步长1000 ms起搏1小时(电生理稳定),药物均溶解于台氏液,通过左室楔型心肌组织块冠状动脉插管灌流。随机分为正常组、LQT2组和AAP10干预组:正常组(n=10)灌流正常台式液、LQT2组(n=10)灌流含100μM d-sotalol的台式液、AAP10干预组(n=10)灌流含100μM d-sotalol和500 nM AAP10的台式液。 在基础状态、AAP10预处理阶段和灌流d-sotalol阶段,观察并记录左室楔型心肌组织块自发性心律失常,以及程序刺激诱发的左室楔型心肌组织块心律失常。QT间期为起搏信号到T波下降支与基线交叉点间的距离;动作电位复极90%时程(APD90)为动作电位0期到复极至90%振幅的时程;TDR为同一心搏M细胞和心外膜复极时间差值。 结果:正常组没有发生尖端扭转性室速(TdP)。与正常组相比较,LQT2组QT间期和跨室壁复极离散度(TDR)显著增大,LQT2组尖端扭转性室速(TdP)发生率也显著高于正常组。与正常组相比较,LQT2组有4/10出现自发性TdP(P=0.087),7/10诱发出TdP(P0.05)。LQT2组同时伴有去磷酸化Cx43水平增高(均P0.001)。与LQT2组相比较,AAP-500nM干预组QT间期和TDR显著缩短(均P0.001)。AAP-500nM干预组TdP的发生率显著小于LQT2组(P0.05),并伴随去磷酸化Cx43水平降低(P0.001)。 结论:缝隙连接激动剂AAP10防止Cx43去磷酸化,减少了犬LQT2模型的跨室壁复极离散度和心律失常发生率,说明犬LQT2模型的缝隙连接可能参与了跨室壁复极离散度的形成。


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