骨髓增生异常综合征中甲基化致病相关基因的筛选研究

【摘要】： 第一部分 MDS细胞系SKM-1中超甲基化基因的初步芯片筛查 目的：应用MeDIP-on-chip (Methylated DNA immunoprecipitation on chip,甲基化DNA免疫共沉淀结合芯片)技术分析、比较骨髓增生异常综合征(MDS)细胞系SKM-1和正常对照样本启动子区CpG岛的甲基化状态,以期获得与正常对照样本相比,SKM-1细胞中发生超甲基化的基因,为MDS的诊断或治疗寻找更好的甲基化基因靶标。 方法：收集20例正常人的外周血单个核细胞,分别抽提DNA后等量混合,制备成混合样本,作为正常对照,同时抽提SKM-1细胞的DNA。将DNA样品超声破碎,甲基化富集,分别用荧光染料Cy3和Cy5标记后与甲基化基因芯片杂交、洗片,用激光扫描仪对芯片进行扫描,再用NimbleScan软件分析Cy3和Cy5的强度,最后用SignalMap软件以Cy5和Cy3的比值(log2Cy5/Cy3, log2 ratio)结合基因GO功能分类和KEGG通路分类为标准,筛选正常对照无或低甲基化而SKM-1细胞超甲基化的基因。 结果：正常对照样本无／低甲基化而SKM-1细胞出现超甲基化的基因共筛选出849个,将每个基因按SignalMap软件分析后log2 ratio值的高低排序,初筛了6个基因,分别为DMRTA2、PAX6、GDNF、POU4F3、LHX1和PGR。每个基因启动子区分别有1-4个不等的CpG岛出现超甲基化。 结论：我们利用甲基化芯片技术成功在SKM-1细胞中筛选了6个超甲基化的基因,为后续实验打下了基础,减少了摸索的盲目性,加强了MDS表观遗传学研究的针对性。 第二部分 初筛基因的亚硫酸氢盐修饰后测序 目的：对甲基化芯片初筛的6个基因进行亚硫酸盐修饰后测序(BSP),观察每个基因启动子区CpG岛发生异常甲基化的比率,验证芯片结果的准确性。 方法：重新收集3例正常人的骨髓标本作为正常对照,以SKM-1细胞和正常对照的骨髓标本为研究对象,分别抽提各样本的DNA,进行亚硫酸氢盐处理,然后将DNA纯化并针对各基因进行PCR扩增。PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳后回收,连接到T载体,再转化大肠杆菌,蓝白斑筛选后挑取克隆、提取质粒最后测序。 结果：测序结果与芯片结果一致。其中GDNF和PAX6基因的甲基化在SKM-1细胞中最为显著。 结论：甲基化芯片技术成熟,可行性强。甲基化芯片初筛后的测序验证,进一步证实了该6个基因在SKM-1细胞中异常甲基化的存在,认为可以进行后续的功能研究。 第三部分 5-氮杂胞苷逆转SKM-1细胞甲基化机制的研究 目的：应用不同浓度的去甲基化药物5-氮杂胞苷处理SKM-1细胞,观察其对SKM-1增殖、凋亡及细胞周期等生物学特性的影响,并结合上述筛选基因探讨其逆转甲基化状态的作用及机制。分析DNA异常甲基化和SKM-1细胞生物学功能的相关性及5-氮杂胞苷抑制SKM-1细胞恶性表型和逆转甲基化状态的作用及其机制。 方法：用不同浓度(2～10μmol／L)5-氮杂胞苷处理SKM-1细胞24～48小时,计数各阶段细胞密度观察其增殖趋势。选取合适的低浓度和高浓度组药物分别处理SKM-1细胞,用相差显微镜和电镜观察药物处理前后细胞形态的变化,流式细胞仪PI法检测细胞生长周期的变化,流式细胞仪PI-Annexin V法检测细胞凋亡的改变,RT-PCR法检测5-氮杂胞苷处理前后基因的表达情况。 结果：5-氮杂胞苷对SKM-1细胞有明显的抑制作用,随着药物浓度的增加,细胞增殖明显减慢；电镜下显示明显的凋亡形态；凋亡细胞明显增加；细胞周期阻滞在S期。5-氮杂胞苷可逆转GDNF和PAX6基因的甲基化状态,促进其mRNA水平的表达。而DMRTA2、PGR、LHX1和POU4F3基因未观察到药物处理前后mRNA水平的表达。 结论：5-氮杂胞苷对SKM-1细胞的增殖有明显抑制作用,增加SKM-1细胞的凋亡率,阻滞细胞周期进入S期,促进GDNF和PAX6基因mRNA水平的表达。DMRTA2、PGR、LHX1和POU4F3基因可能存在其它表观遗传机制协同甲基化共同作用于肿瘤细胞的生长。 第四部分 临床标本中甲基化状态的检测 目的：将筛选得到的GDNF和PAX6基因,在临床标本中进一步行甲基化状态的相关分析,观察其在临床病例中的甲基化情况,分析变化趋势,以期发现对MDS诊断或评估预后有价值的基因。 方法：骨髓增生异常综合征各期患者共5例,采集每个患者的骨髓液3-5ml,肝素抗凝,淋巴细胞分离液分离单个核细胞,磁珠法分选CD34+细胞。经亚硫酸氢盐处理后行甲基化PCR,分析两基因的甲基化状态。 结果：在MDS转白患者和MDS-RAEB患者中,PAX6甲基化条带阳性而非甲基化条带阴性；在获得血液学缓解的MDS患者中亦扩增出PAX6甲基化条带。 在MDS转白患者和MDS-RAEB患者中GDNF同时扩增出甲基化条带和非甲基化条带；在治疗后获得血液学缓解的MDS患者中只扩增出非甲基化条带；在环形铁粒幼细胞增多症患者中只扩增出甲基化条带。 结论：GDNF和PAX6基因在临床标本中的甲基化状态与细胞系中的筛选结果部分一致。考虑患者个体差异和疾病的异质性,另外甲基化PCR本身存在假阴性和假阳性的可能,有待于大规模临床标本的进一步分析,以期发现GDNF和PAX6基因的甲基化状态在MDS诊断、预后及疗效评估中的价值和意义。