血管紧张素Ⅱ受体基因多态性与肾上腺醛固酮腺瘤发病风险及预后的相关性研究

【摘要】： 背景 原发性醛固酮增多症(Primary aldosteronism, PA)是由于醛固酮(Aldosterone,ALD)自主高分泌引起不同程度的血浆肾素抑制、水钠潴留、高血压或者低血钾为主要表现的临床症候群。PA是引起继发性高血压的最常见病因之一,PA引起的高血压占高血压人群的比例已超过10%,在抵抗性(顽固性)高血压患者中更是高达20%左右。PA最常见的亚型是肾上腺醛固酮腺瘤(Aldosterone-Producing Adenoma,APA)和特发性醛固酮增多症(Idiopathic Hyperaldosteronism,IHA),分别占PA患者的60%和30%左右。然而,APA和IHA的发病机制目前仍尚不清楚。一般认为IHA多采用药物治疗,APA行外科手术治疗,虽然APA的手术治疗能够有效控制醛固酮的高分泌和治愈大部分患者的低血钾,但是只能使50%患者血压完全恢复正常,仍有部分APA患者术后血压控制不佳。 肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)是机体血压、水盐平衡以及醛固酮合成与释放的最主要的调节因素,这些调节功能似乎均是通过血管紧张素Ⅱ与其最主要的两个受体亚型——血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensinⅡType 1 Receptor, AT1R)和血管紧张素Ⅱ2型受体(AngiotensinⅡType 2 Receptor, AT2R)的结合来介导的。在肾上腺皮质,肾素、血管紧张素原和AT1R/AT2R共同构成了局部RAS调节,不依赖于循环RAS调节来调控ALD的合成与分泌。AT2R有对抗AT1R介导的血管紧张素Ⅱ效应,如对抗AT1R介导的细胞增殖、缩血管效应、心血管的纤维化等。越来越多的研究发现AT1R、AT2R基因多态性和高血压、心肌病、脑中风等心脑血管疾病相关,AT1R基因多态性还和女性乳腺癌发病有关。AT1R、AT2R基因由于遗传或者环境因素的影响,可能导致其表达量的紊乱或者活性的变化,使它们的生理调节功能失调,从而导致多种疾病的发生。因此针对APA的特点,我们将从AT1R、AT2R基因相关位点多态性入手,研究AT1R、AT2R基因多态性与APA发病风险、基因表达以及APA临床预后的相关性,从而进一步了解APA的发病机制,指导APA的临床预判和治疗。 方法 1.用DNeasy Blood Tissue DNA提取试剂盒提取148例APA患者的组织DNA及192例正常人群外周血DNA,-20℃保存。 2.选取50例新鲜APA组织和50例正常肾上腺组织,采用Trizol法提取总RNA,RT-PCR半定量分析AT1R和AT2R mRNA在APA组织和正常肾上腺组织中的表达差异。免疫组织化学染色检测AT1R和AT2R的蛋白表达情况。进一步用实时荧光定量RT-PCR检测不同组织中AT2R mRNA表达水平。 3.根据公共SNP数据库(http://www.hapmap.org/和http://ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)以及相关文献的报道,选择AT1R和AT2R基因中频数≥0.05,且与血压调控、心血管疾病密切相关的4个SNP位点,包括AT1R基因的rs5182、rs5186两个SNP位点,和AT2R基因的rs5194、rsl403543两个SNP位点。 4.采用MGB-Taqman探针法对AT1R、AT2R基因的4个多态性位点分别进行基因型检测。 5.收集148例APA患者术前血压、生化指标、肿瘤直径等临床资料,并进行术后血压恢复情况随访。术后6个月BP 140/90mmHg,且不需任何抗高血压药物者认为术后BP正常,否则认为术后持续性高血压。 6.SNPassoc R语言统计包中,分析各SNP位点基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡(HWE)(P0.05认为符合HWE)。应用SPSS16.0和R statistics program 2.7.0软件包分析AT1R、AT2R基因多态性与APA的发病、基因表达水平、以及术后血压恢复的相关性。以优势比(odds ratio, OR)和95%可信区间(confidenceinterval, CI)来表示相对危险度。P0.05或95%可信区间(CI)不包含1.0认为有统计学意义。 结果 1.多态性位点基因型检测及分布：4个双等位基因多态性位点包括rs5182、rs5186、rs5194和rsl403543均成功检测。各位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(e0.05)。 2.AT1R、AT2R基因多态性与APA发病危险相关性：正常组和疾病组人群的性别分布、年龄和身体质量指数(BMI)无统计学差异(P0.05)。4个SNPs中仅发现rs5194多态性和单位点APA发病危险相关。等位基因频率分析发现, APA组AT2R基因rs5194位点A等位基因频率(0.49)要高于正常人群组(0.35)(χ2=12.08,P=0.001),差异有统计学意义。以rs5194纯合子基因型GG为参照,纯合子基因型AA和杂合子基因型GA的APA发病风险均增高(OR=2.66,95%CI=1.45-4.87和OR=1.67,95%CI=1.02-2.74)。rs5194位点单核苷酸多态性在不同的遗传模型,包括显性模型、隐性模型以及加性模型中均与APA发病相关联。(OR=1.94,95%CI=1.23-3.06,P=0.003；OR=2.01,95%CI=1.17-3.45,P=0.01；和OR=1.64,95%CI=1.21-2.20,P=0.001) 3.AT1R、AT2R基因多态性与APA患者术后血压恢复的关系：随访了128例APA患者,其中术后BP正常者72例,术后持续性高血压者56例。两组在性别、年龄、BMI、肿瘤大小、术前高血压水平以及持续时间没有明显差异,而术后持续性高血压组术前所需降压药≥3种的患者要明显多于术后血压正常组,分别为39／56(69.82%)和26／72(36.11%),P=0.000。随访患者4个位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。单个位点分析发现,4个SNP位点中只有AT2R基因rs1403543(G／A)位点多态性和术后持续性高血压相关联,其纯合子GG基因型患者要比AA基因型或GA基因型患者术后出现持续性高血压的危险性高(OR=5.00,95%CI=1.31-19.15,P=0.01)。 4.血管紧张素Ⅱ受体基因多态性与其表达的关系：半定量分析发现AT1R mRNA在APA组织、瘤旁组织以及正常肾上腺组织中的表达无明显差异(P0.05)；AT2RmRNA在APA组织中的表达低于正常肾上腺组织(P0.05)。而且免疫组织化学染色分析发现,AT1R蛋白在腺瘤和正常肾上腺组织中均为阳性表达,AT2R蛋白在腺瘤组织中的表达明显下调。针对AT2R的实时荧光定量PCR定量分析也进一步证实了AT2RmRNA在APA组织中的表达低于正常肾上腺组织(P0.05)。Rs5194含A等位基因的基因型(AA+GA) AT2R mRNA表达量约为纯合子GG基因型的1／8,在APA组织和正常肾上腺组织均有显著差异性(P=0.000)。未发现rs1403543不同基因型之间AT2RmRNA表达量的差异。 结论 1.AT2R基因单核苷酸多态性与APA发病危险以及APA患者术后血压的恢复与否相关联,对AT2R基因多态性检测可能对预测APA的发病危险提供有用的遗传信息,AT2R基因多态性也可能成为一个预判APA临床预后的遗传标记。 2.AT2R基因多态性可能通过下调AT2R mRNA的表达量,从而导致APA的发病,其确切分子机制还有待我们下一步深入研究。 3.与高血压密切相的AT1R基因的遗传变异和APA的发病危险或者临床表型可能没有相关性。