表皮生长因子受体抑制剂对大鼠脊髓损伤后轴突再生微环境的作用机制研究

【摘要】： 第一部分表皮生长因子受体抑制剂AG1478对大鼠脊髓损伤后GAP-43的表达及运动功能缺损的影响 目的：脊髓损伤后胶质瘢痕的形成及髓鞘相关抑制分子的产生是导致轴突不能有效再生的重要原因。而表皮生长因子受体的活化可导致静息星形胶质细胞反应性增生并形成胶质瘢痕,而且表皮生长因子受体抑制剂AG1478通过减轻髓鞘相关抑制分子及硫酸软骨素蛋白聚糖对轴突再生的抑制作用而促进了视神经轴突的再生,因此表皮生长因子受体抑制剂AG1478可能对脊髓损伤后轴突的再生有促进作用而改善脊髓损伤所导致的神经功能缺损。在本实验中我们通过在损伤脊髓局部给予表皮生长因子受体抑制剂AG1478以观察AG1478能否上调相关生长蛋白-43(GAP-43)的表达及其是否改善大鼠脊髓损伤后神经功能缺损症状。 方法：应用重物坠落打击法建立大鼠脊髓损伤模型,假手术组仅切除T10椎板。48只健康雌性成年SD大鼠随机分为假手术组、损伤对照组和AG1478治疗组。AG1478治疗组大鼠在脊髓损伤后立即在局部给予含有0.2 ml2mM的AG1478的明胶海绵外敷治疗,而损伤对照组和假手术均在术后立即给予含溶剂(二甲基亚砜)的明胶海绵外敷作对照治疗。应用免疫荧光技术和western blot检测各组大鼠脊髓损伤后28天损伤区域生长相关蛋白-43(GAP-43)的表达情况。应用BBB评分法对大鼠脊髓损伤后第1d及以后每周(共8周)后肢运动功能进行评分。在损伤前及损伤后每周(共8周)测量各组大鼠体重。 结果：免疫荧光检测显示在损伤后28天AG1478组GAP-43阳性细胞计数表达较对照组明显增多(P0.01)。Western blot印迹分析也显示AG1478组GAP-43表达较对照组明显上调(P0.01)。损伤对照组与AG1478治疗组大鼠在伤后第1天后肢均几乎完全瘫痪,表明两组大鼠损伤程度一致。经重复测量数据方差分析检验后显示AG1478组BBB评分明显高于对照组(P0.01)。经重复测量数据方差检验分析显示AG1478组大鼠体重明显重于对照组大鼠体重P0.05)。 结论：脊髓损伤后立即在损伤局部给予表皮生长因子受体抑制剂AG1478干预,可以改善大鼠脊髓损伤后的神经功能缺损并明显上调与轴突生长相关的GAP-43。表皮生长因子受体抑制剂AG1478对脊髓损伤有确切的治疗作用,这提示其可能是中枢神经系统损伤的有效保护剂。 第二部分表皮生长因子受体抑制剂AG1478对大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质活化增生的影响 目的：星形胶质增生被认为在脊髓损伤的病理生理改变中起着极其重要的作用,而在中枢神经系统损伤的病理生理改变中星形胶质细胞的增生与表皮生长因子受体的活化密切相关。因此我们试图应用表皮生长因子受体抑制剂AG1478对脊髓损伤进行干预以观察表皮生长因子受体抑制剂AG1478对脊髓损伤后星形胶质细胞上磷酸化表皮生长因子受体(pEGFR)的表达和反应性胶质增生及轴突生长抑制因子硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGs)产生的影响 方法：应用重物坠落打击法建立大鼠脊髓损伤模型,假手术组仅切除T10椎板。45只健康雌性成年SD大鼠随机分为假手术组、损伤对照组和AG1478治疗组。AG1478治疗组大鼠在脊髓损伤后立即在局部给予含有0.2 ml2mM的AG1478的明胶海绵外敷治疗,而损伤对照组和假手术均在术后立即给予含溶剂(二甲基亚砜)的明胶海绵外敷作对照治疗。分别于损伤后14d、28d处死各组实验大鼠。应用免疫荧光技术和western blot技术检测GFAP在损伤后14天、28天的表达水平变化情况；采用免疫荧光双标技术检测脊髓损伤后14天各组大鼠星形胶质细胞表达磷酸化表皮生长因子受体(pEGFR)的情况并检测伤后28天时星形胶质细胞表达硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGs)的情况。 结果：假手术组GFAP阳性细胞稀少,形态纤细；而损伤对照组在伤后14天GFAP表达明显上调,星形胶质细胞呈突触增多变大的活化状态,伤后28天典型胶质瘢痕出现；在AG1478治疗组GFAP的表达明显受到抑制,而伤后28天无明显胶质瘢痕形成。GFAP Western印迹分析也显示在损伤后14天和28天,AG1478组GFAP的表达均明显低于对照组假手术组(P0.01)。假手术组pEGFR和GFAP表达均很弱,无荧光染色双标阳性区域,表明正常脊髓组织的星形胶质细胞不表达pEGFRo对照组pEGFR和GFAP均有强表达,同时损伤组脊髓组织病灶周围存在明显空洞和疤痕改变,且在空洞周围疤痕存在pEGFR和GFAP双标阳性区域,表明脊髓损伤后星形胶质细胞表达pEGFR,然而AG1478组pEGFR和GFAP的表达均较弱,其荧光强度较对照组明显较弱(P0.01),且无pEGFR和GFAP双标阳性区域,表明AG1478对pEGFR和GFAP的表达均有明显抑制作用。假手术组脊髓组织CSPGs和GFAP表达均较弱；而对照组CSPGs和GFAP均有较强表达,且损伤中心CSPGs表达很强,在胶质瘢痕区域CSPGs和GFAP存在明显双标阳性区域,表明活化星形胶质细胞大量表达CSPGs;在AG1478组脊髓组织中CSPGs和GFAP的荧光强度均明显低于照组(P0.01),这表明AG1478能明显抑制CSPGs和GFAP的表达。 结论：脊髓损伤后星形胶质细胞明显上调pEGFR的表达,而表皮生长因子受体抑制剂AG1478通过对星形胶质细胞上pEGFR活化的抑制而导致其对脊髓损伤后反应性星形胶质增生及抑制因子CSPGs有明显抑制作用。 第三部分表皮生长因子受体抑制剂AG1478对大鼠脊髓损伤后髓鞘脱失及髓鞘相关抑制因子表达的影响 目的：外伤性脊髓损伤不仅造成神经元及轴突严重损伤而且导致少突胶质细胞受到严重伤害,而少突胶质细胞和轴突损害最终导致脊髓髓鞘的大量脱失。同时少突胶质细胞损伤后会释放大量髓鞘相关抑制分子,这些抑制分子对脊髓损伤后轴突的再生产生极其不利的影响。而表皮生长因子受体抑制剂AG1478对脊髓损伤有良好的治疗作用,故我们试图应用表皮生长因子受体抑制剂AG1478干预脊髓损伤以观察AG1478对大鼠脊髓损伤后髓鞘脱失及髓鞘相关抑制因子MAG、Nogo-A和OMgp mRNA表达的影响。 方法：将33只健康雌性成年SD大鼠随机分为损伤对照组(重物坠落打击法建立脊髓损伤模型后立即在损伤局部给予含二甲基亚砜的明胶海绵外敷作对照治疗),AG1478治疗组(重物坠落打击法建立模型后立即在损伤局部给予含有0.2ml 2mM的AG1478的明胶海绵外敷治疗)和假手术组(只切除椎板并立即在损伤局部给予含二甲基亚砜的明胶海绵外敷作对照治疗)。各组大鼠均在脊髓损伤后14和28天处死。应用勒克司坚牢蓝染色(Luxol Fast Blue)方法分析各组大鼠脊髓损伤后28天髓鞘脱失情况。利用RT-PCR方法检测各组大鼠脊髓损伤后14天、28天髓鞘相关抑制因子MAG、Nogo-A和OMgp mRNA表达的情况。 结果：在假手术组大鼠脊髓切片Luxol Fast Blue染色中,脊髓组织呈均匀的亮蓝色；而在对照组中损伤部位不能正常着色,这提示病灶中心髓鞘严重脱失；而在AG1478治疗组中脊髓组织切片不能正常着色的范围明显缩小,其髓鞘脱失面积明显小于对照组(P0.01)。而髓鞘相关抑制分子MAG、Nogo-A和OMgp mRNA在假手术组有较弱的表达；在损伤对照组,脊髓损伤后14天及28天髓鞘相关抑制分子的表达均明显增加；而在AG1478组,脊髓损伤后14天及28天髓鞘相关抑制分子的表达均明显低于对照组(P0.01)。 结论：局部应用表皮生长因子受体抑制剂AG1478可改善大鼠脊髓损伤后髓鞘的脱失并能减少大鼠脊髓损伤后髓鞘相关抑制分子的MAG、Nogo-A和OMgp mRNA表达。