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支气管哮喘相关基因的多态性研究

吴小慧  
【摘要】: 支气管哮喘是一种常见的慢性呼吸系统疾病,在临床上常表现为反复发作的喘息、咳嗽、呼吸困难等,受遗传因素和环境因素间复杂的相互作用而发病。近几十年来,随着工业化的进展和环境的改变,哮喘发病率和死亡率在大多数国家呈上升的趋势。家系和双子研究反映出哮喘发病有很强的个体遗传特质。使用定位克隆技术和候选基因的方法,发现人类多个染色体的不同区域及多个候选基因与哮喘发病相关,其中就有位于人类染色体5q31-33区的TIM-4基因、IL-4基因、IL-13基因、CD14基因,位于染色体16p11-12区的IL-4Ra基因,以及位于12q14-24区的STAT6基因。研究表明,Th1/Th2细胞及其分泌的细胞因子失衡在哮喘的发病机制中起着主要的作用,而哮喘通常被认为是一种Th2型疾病。TIM-4基因是新近发现的TIM基因家族中一员,与TIM-1结合后可提供一个协同刺激信号介导Th2细胞的增殖与分化。IL-4,IL-13已被认为是传统的哮喘易感基因,国内外多篇文献报道了关于其基因多态性与哮喘的关联性研究,但结果却未能得到统一。IL-4Ra基因是IL-4α,IL-13基因受体的共同组成部分,STAT6基因是IL-4/IL-13通路执行生物学功能的转录激活因子,两者同样在哮喘的发病中起着重要的作用。CD14基因位于哮喘易感区5q31.1,有报道称位于启动子区的-C159T突变与儿童哮喘及成人高IgE相关。因为哮喘是一种复杂的多基因性疾病,因此研究多个基因之间的交互作用对哮喘发病的影响是十分必要的。虽然上述6个基因的多态性位点在一些人群中报道与哮喘具有相关性,但其基因间的交互作用与哮喘的关联却研究甚少,因此我们研究其基因的交互作用对哮喘的影响可能会对哮喘的发病机理带来新的认识。一般来说,在疾病的关联研究中,如果仅仅只使用常规的病例对照研究可能由于人群分层的影响而带来假阳性/假阴性结果,因此,我们采取病例对照和家系对照相结合的方法,避免这些不利的影响,从而能更加严格地说明其基因多态性与哮喘的相关关系。 本课题我们首先探讨了以CRS-RFLP法研究TIM-4基多态性与支气管哮喘的相关关系,同时也是基于CRS-RFLP方法学的建立。然后基于CRS-RFLP的基础上,使用病例对照研究了IL-4, IL-13, IL-4Rα, STAT6, CD14基因共8个SNPs的单个SNP及单倍型与支气管哮喘的关系,同时,运用MDR方法来分析其基因交互作用与哮喘的相关关系。最后我们使用核心家系资料,利用单个SNP、单倍型的关联研究,以及基于家系的基因交互作用来探讨上述5个哮喘候选基因的的8个SNPs与中国中部地区汉族人群支气管哮喘及血清总IgE的相关关系。本研究共分为如下的三个部分: 第一部分 运用CRS-RFLP法研究TIM-4基多态性与支气管哮喘的相关关系 目的探讨T细胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白-4 (T cells immunoglobulin domain and mucin domain protein-4, TIM-4)基因外显子2区Lys65Lys(G/A)、外显子3区Val172Met(G/A)、外显子9区Val365Met(G/A)的单核苷酸多态性(SNP)与中国中部地区汉族人群支气管哮喘及其表型的相关关系。 方法采用创造酶切位点-限制性片段长度多态性(CRS-RFLP)的方法对中国中部地区185例哮喘患者和162例健康者TIM-4基因外显子2区Lys65Lys(G/A)、外显子3区Val172Met(G/A)、外显子9区Val365Met(G/A)的多态性进行分析,计算基因型和等位基因频率,并比较其在两组中的差异。采用化学发光法测定血清总IgE含量,比较其在哮喘患者不同基因型之间的差异。 结果(1)TIM-4基因外显子2区Lys65Lys(G/A)位点GG、GA基因型频率,G、A等位基因频率在哮喘组和对照组均无统计学意义(P0.05),本位点在中国中部地区汉族人群共347个标本中未检测到AA基因型。(2)本试验在中国中部地区汉族人群共347个标本中未检测到TIM-4外显子3区Val172Met(G/A)的多态性,所有标本均为GG型。(3)本试验在中国中部地区汉族人群共347个标本中未检测到TIM-4外显子9区Val365Met(G/A)的多态性,所有标本均为GG型。(4)哮喘组血清总IgE含量在外显子2区Lys65Lys(G/A)位点不同基因型间差异无统计学意义。 结论TIM-4基因外显子2区Lys65Lys(G/A)存在单核苷酸多态性变异,但该位点的变异与中国中部地区汉族人群支气管哮喘易感性及其表型血清总IgE水平无关;TIM-4基因外显子3区Val172Met(G/A)、外显子9区Val365Met(G/A)在中国中部地区汉族人群中未发现单核苷酸多态性。 第二部分 IL-4, IL-13, IL-4Rα, STAT6, CD14基因多态性的单个SNP及其基因交互作用与支气管哮喘的相关性研究 目的探讨IL-4 -C33T, IL-4 -C589T, IL-13 R130Q, IL-13 C1923T, IL-4Ra I75V, IL-4Ra Q576R, CD14-C159T, STAT6 C2892T多态性位点:1).单个SNP:2).IL-4,IL-13,IL-4Ra基因单倍型;3).上述8个多态性位点的基因交互作用与中国中部地区汉族儿童哮喘的相关性。 方法采用创造酶切位点-限制性片段长度多态性(CRS-RFLP)的方法对中国中部地区252例哮喘儿童和227例健康儿童共479名儿童IL-4 -C33T, IL-4 -C589T, IL-13 R130Q, IL-13 C1923T, IL-4RαI75V, IL-4Ra Q576R, CD14-C159T, STAT6 C2892T的多态性进行分析。使用基因计数法计算单个SNP与哮喘的相关关系;使用SHEsis在线软件对IL-4,IL-13,IL-4Ra基因分别进行单倍型分析;使用多因子降维法(MDR)检测8个SNPs之间的基因交互作用与哮喘的相关关系。 结果8个SNP中仅IL-13 R130Q和IL-13 c1923T位点的基因型频率和等位基因频率在哮喘儿童与健康儿童间差异有统计学意义。IL-13 R130Q位点的A等位基因和IL-13 C1923T位点的T等位基因具有较高的哮喘发病风险(OR=1.59,95%CI1.20-2.09;OR=1.57,95%CI 1.19-2.08)。其余6个多态性位点的单个SNP与哮喘无相关性。通过单倍型分析,由C1923T和R130Q构成的IL-13基因单倍型中,C-G和T-A单倍型与儿童哮喘显著相关(P0.05)。由175V和Q576R构成的IL-4Ra基因单倍型中,G-A和A-A单倍型与儿童哮喘具有相关性(P0.05)。由-C33T和-C589T构成的IL-4基因单倍型中,未检测到与哮喘显著相关的单倍型。通过MDR分析,我们检测到由IL-4 -C33T, IL-13 R130Q, IL-4RαI75V, IL-4RαQ576R, STAT6 C2892T, CD14-C159T 6个SNPs位点构成的最佳基因交互模型,具有潜在的哮喘发病风险(OR=4.43,95%CI 1.30-15.04;P0.001,通1000次排列检验)。 结论IL-13基因多态性单个SNP及其单倍型与中国中部地区儿童哮喘的易感性相关,提示IL-13在哮喘的发病中起着重要作用。IL-4Ra基因单倍型与哮喘具有关联兴,提示IL-4Ra可能以单倍型的形式影响哮喘的易感性。由IL-4-C33T, IL-13 R130Q, IL-4RαI75V, IL-4RαQ576R, STAT6 C2892T, CD14-C159T构成的基因交互模型可增加中国中部地区儿童患哮喘的风险性。 第三部分 基于家系的IL-4, IL-13, IL-4Rα, STAT6, CD14基因多态性与支气管哮喘的易感性研究 目的基于核心家系资料基础,探讨IL-4 -C33T, IL-4 -C589T, IL-13 R130Q, IL-13 C1923T, IL-4RαI75V, IL-4Ra Q576R, CD14-C159T, STAT6 C2892T各多态性位点:1).单个SNP;2).IL-4,IL-13,IL-4Ra基因单倍型;3).上述8个SNPs位点之间的基因交互作用与中国中部地区汉族人群支气管哮喘及其表型的关系。 方法采用创造酶切位点-限制性片段长度多态性(CRS-RFLP)的方法对中国中部地区126个核心家系(由一名哮喘患者及其双亲组成)共378名成员IL-4-C33T, IL-4-C589T, IL-13 R130Q, IL-13 C1923T, IL-4RαI75V, IL-4Ra Q576R, CD14-C159T, STAT6 C2892T的多态性进行分析。采用化学发光法测定血清总IgE含量。采用基于家系的单倍型相对风险分析(HRR)进行各单个SNP与哮喘的传递不平衡关联分析。使用FBAT软件分析单倍型与哮喘之间的关联性,及单个SNP、单倍型与哮喘表型血清总IgE的相关性。使用MDR软件分析上述8个SNPs位点的基因交互作用与哮喘易感性的关系。 结果经单个SNP与哮喘的HRR分析,各SNP位点与哮喘均无显著相关性。经FBAT分析,IL-4,1L-13,IL-4Ra各基因单倍型与哮喘均无相关性。IL-13基因C1923T位点T等位基因和R130Q位点A等位基因与哮喘表型血清总IgE水平相关(P=0.038;P=0.043);其中,C1923T的T等位基因和R130Q的A等位基因均具有较高的血清总IgE水平观察值,是血清高IgE水平的风险因子。由c1923T和R130Q构成的IL-13基因单倍型CG及由175V和Q576R构成的IL-4Rα基因单倍型AA与血清总IgE水平相关(P=0.032;P=0.026)。通过MDR分析,我们检测到由IL-4-C33T, IL-13 R130Q, IL-4RαI75V, IL-4Ra Q576R, STAT6 C2892T, CD14-C159T 6个SNPs位点构成的最佳基因交互模型,具有潜在的哮喘发病风险(OR=12.08,95%CI 1.86-78.52;P0.001,通1000次排列检验)。 结论IL-13基因多态性以单个SNP及单倍型形式影响哮喘相关表型血清总IgE的水平。IL-4Rα基因多态性以单倍型的形式影响血清IgE的水平。由IL-4-C33T, IL-13 R130Q, IL-4RαI75V, IL-4Ra Q576R, STAT6 C2892T, CD14-C159T构成的基因交互作用可增加中国中部地区汉族人群罹患哮喘的易感性。


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